污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究

I時光飛逝，四年的博士學習生活不知不覺中即將結束，在此離別之際，感觸頗多，向幫助過我的人們致以最誠摯的感謝!首先要感謝我的導師劉俊新研究員，是劉老師給了我來到中科院繼續(xù)深造、攻讀博士學位的寶貴機會，改變了我的人生。博士期間，從論文開題到實驗安排，從數(shù)據(jù)整理到結果分析，我獲得的點點滴滴進步，無不滲透著劉老師的心血。劉老師淵博的學識和對學科高屋建瓴的認識總是令我感到由衷的欽佩，而他對待工作一絲不茍、認真嚴謹?shù)膽B(tài)度無時無刻不深深地感染著我。尤其在文章寫作方面，每當我面對困惑一籌莫展的時候，劉老師總能找到問題的關鍵，幫我梳理思路、理清頭緒，使問題迎刃而解。劉老師無私的關懷和幫助，令我深受感動，對您的感恩之情學生無以為報，唯有銘記在心，將其化為今后人生道路上的一盞明燈，給我領航，指引著我更加努力和勤奮的工作!再次向您表達深深的感謝，望您在繁重的工作中多注意休息，保重身體!在此，還要向水污染控制技術研究組的李琳老師、肖本益老師、郭雪松老師、梁瀚文老師和韓云平老師致以誠摯的感謝。感謝李琳老師在論文寫作實驗設計上給予的耐心指導和無私幫助!每次面對壓力和困難意志消沉的時候，您耐心的傾聽和關切的話語總能使我倍受鼓勵走出困境，李老師平易近人的態(tài)度、樂于助人的品質和對待工作兢兢業(yè)業(yè)的精神永遠是我學習的榜樣!感謝肖老師在實驗室儀器使用和裝置維護上給予的指導和幫助，肖老師為人熱情樂于助人，對待學生親切和藹，在我遇到困難的時候總能提供最耐心熱忱的幫助，再次向您表示感謝!感謝郭老師在實驗思路和裝置設計上提供的指導和幫助，有了您的建議，才使我的實驗室模擬裝置能夠順利穩(wěn)定的運行。感謝梁老師在工作和生活上給予的關心和幫助，使我快速度過了初期生活上的不適，順利開始了博士階段的學習。感謝韓老師在實驗和生活上對我無微不至的幫助和關懷，我必定銘記在心，你既是老師也是師兄，既是朋友更似兄長!在此特別祝你新婚快樂!再次向水污染控制技術研究組的各位老師表示感謝，祝你們在今后的工作和生活中一切順利!感謝水污控的各位兄弟姐妹，有了你們，枯燥平淡的科研生活變得豐富有趣，和你韓昌福、高敏、周鑫、鄒娟、袁棟棟、阮曉東、王旭、李美艷、張瑞娜、閻鴻、周利、吳曉鳳、張夢竹、丁文杰、郭旋、張婧贏、李義晉、鄭嘉熹、方云、張鑫磊、楊芳、彭I謝意，感謝你們在四年期間給我的關心和幫助!我會非常懷念與你們在一起的日子，祝愿你們一切順利!中給予的熱情幫助!感謝大氣所李寶江工程師以及生態(tài)中心牟玉靜老師和劉俊峰老師在氣體檢測方面提供的幫助!最后，要感謝我的父母，你們的支持和期待是我不斷前進的動力!感謝多年來父母對我無私的培養(yǎng)和關心，兒子必定以實際行動來報答二老的養(yǎng)育之恩!感謝所有幫助過我的親人和朋友，謝謝您們!2013年5月I城市污水處理過程產生溫室氣體問題已引起人們的關注。本論文將污水處理廠現(xiàn)場調查與實驗室模擬實驗相結合，以明確城市污水處理廠溫室氣體產生和逸散特征，探討污水處理過程中溫室氣體產生的主要影響因素，為污水處理廠溫室氣體減排提供基礎數(shù)選擇北京城市污水處理廠的Orbal氧化溝、缺氧/厭氧/好氧(倒置A2O)和厭氧/缺氧/好氧(A2O)3種典型污水處理工藝進行了為期9個月的綜合調查研究，以了解和比較不同工藝溫室氣體產生與逸散特征。結果表明：①CO?主要在好氧處理單元產生并去除單位質量COD產生的CO?量越大；②CH?的最大逸散量出現(xiàn)在好氧單元，然而研究發(fā)現(xiàn)，除倒置A2O的厭氧單元產生少量的CH?外，其它2個工藝幾乎不產生CH4,工藝中各單元逸散出的CH4主要來自于污水處理廠進水中溶解態(tài)CH4,而機械或鼓風曝氣促進了CH?的逸散；③N?O主要產生于好氧處理單元，這與傳統(tǒng)的觀點不一致，此外，以溶解態(tài)形式隨出水排出污水處理廠的N?O量大于污水處理工藝各單元逸散的N?O量之和。根據(jù)調查結果，Orbal氧化溝、倒置A2O和A2O工藝的CO?釋放因子(包括各單元逸散的量和隨出水排出的量)分別為261.3gCO?/kgCOD、227.3gCO?/kgCOD和319.3gCO?/kgCOD(89.7gCO?/m3*、87.0gCO?/m3和155.7gCO?/m3*);CH?的排放因子分別為1.21gCH4/m3*、0.72gCH?/m3和0.40gCH/m3*;N?O的排放因子分別為3.6gN?O/kgTN、2.3gN?O/kgTN和0.8gN?O/kgTN(206.1mg為了考察污水處理過程N?O產生的主要影響因素，采用實驗室模擬裝置開展了A2o工藝產生N?O特征研究，結果表明，A2O工藝進水COD/TN和各單元DO濃度對N?O的產生有重要的影響。提高A2O工藝好氧單元DO濃度會使系統(tǒng)中氨化細菌(AOB)和亞硝化細菌(NOB)含量上升，亞硝酸鹽還原酶(nirS)和氧化亞氮還原酶(nosZ)產物產生；進水COD/TN的升高，會使系統(tǒng)中AOBNOBnirSnosZ量上升，增強系統(tǒng)反硝化效果，顯著降低N?O產生量。為了探討好氧單元大量產生N?O的原因，采用好氧生物反應器試驗裝置對好氧條件污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究下N?O產生途徑進行了研究。根據(jù)自然界中氮循環(huán)原理，分別以硝化過程中不同中間產物NH?1-N、NH?OH、NO?-N為底物開展模擬實驗。結果表明，N?O的產生量與NO?-N濃度變化密切相關，由此可確定好氧反應器中的N?O主要通過反硝化途徑產生。隨后進行了污泥絮體FISH圖像層切掃描實驗以及DO和N?O微電極污泥絮體穿刺實驗，結果顯示，在好氧生物反應器內，大粒徑(>200um)污泥絮體內部存在缺氧微環(huán)境，并分布有反硝化細菌，而AOB和NOB在絮體內外都有分布。這種DO和微生物種群分布特點導致了污泥絮體內部反硝化作用的發(fā)生，并有N?O產生和累積。污水中的有機物會使絮體外部的好氧微生物耗氧量增加，增大O?的傳質阻力，加劇絮體內部缺氧區(qū)的形成，導致N?O產生量增大。關鍵詞：城市污水處理廠，溫室氣體，釋放因子，產生與逸散特征，好氧過程氧化亞氮產生途徑 ABSTRACTVABSTRACTTheemissionofgreenhousegas(GHG)fromwastewatertreatmentprocesseshasgainedincreasingattentioninrecentyears.ThepresentstudydefinedthecharacteristicsofGHGsgenerationandemissionfromthewastewatertreatmentplant(WWTP)viaon-siteinvestigationcombinedwithlab-scalesimulationexperiment.ThefactorsonGHGsproductionwerealsodiscussed.ResultsobtainedfromthisstudyprovidedbasicdataandtheoreticalsupportforWWTPsinGHGsreduction.TheinvestigationofGHGgenerationandemissionhadbeencarriedoutfor9-monthsintwoWWTPsofBeijing.Threetypicalwastewatertreatmentprocesses,Orbaloxidationditchprocess,anoxic/anaerobic/aerobicprocess(reversedA2o)andanaerobic/anoxic/aerobic(A2o)process,wereselectedforrealizingandcomparingcharacteristicsofGHGfromdifferentprocesses.Resultsshowedthat:①CO?wasmainlyproducedandreleasedfromaerobictreatmentunitsAndtheprimaryfactoronCO?productionwassludgeretentiontime(SRT).HighconcentrationofCO?willgenerateunderlongSRTinCODremovingunits.②ThemostemissionamountofCH?appearedinaerobictreatmentunit.ItwasfoundthatCH4hardlyproducedinOrbaloxidationditchandA2oprocesswhereasonlysmallamountofCH?wasgeneratedinanaerobicunitofreversedA2oprocess.CH?emissionobservedinWWTPwasmainlyfromthosedissolvedininfluentwater.ThemechanicalagitationoraerationinWWTPsbroughtaboutthemigrationofCH?fromwatertoatmosphere.③N?Owasmainlygeneratedfromaerobicunitwhichwasquitedifferentfrompreviousreports.TheamountofdissolvedN?OtakenbyeffluentwasmorethanthoseemittedfromallthetreatmentunitsinWWTPs.TheCO?emissionfactors(includingtheemissionamountofunitsanddissolvedamounttakenbyeffluent)were261.3gCO?/kgCODremoved(89.7gCO?/m3wastewate)(Orbaloxidationditchprocess),227.3gCO?/kgCODremoved(87.0gCO?/m3wastewater)(reversedA20process)and319.3gCO?/kgCODremoved(155.7gCO?/m3wastewater)(A2Oprocess),respectively.TheCH?emissionfactorswere1.21gCHu/m3wastewater(Orbaloxidationditchprocess),respectively.TheN?Oemissionfactorswere3.6gN?O/kgTNremoved(206.1mg污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究(A2Oprocess),respectively.Alab-scalesimulationexperimentwascarriedouttoinvestigatetheprimaryfactorsonN?OgenerationinA2oprocess.ResultsshowedthattheratioofCOD/TNandtheDOcouldimpactsignificantlyonN?Oproduction.Theconcentrationsofammonia-oxidizingbacteriaA20process.Atthesametime,thereductionofnitritereductaseencodinggene(nirS)andnitrousoxidereductaseencodinggene(nosZ)couldbeobserved,whichledtotheinhibitionofdenitrificationinthetreatmentsystem.Whencarbonsourcewasinsufficient,N?Ogeneratedasanintermediateintheprocessofdefinification.Onthecontrary,theriseofThenitrificationintermediates,NH?'-N,NH?OHandNO?N,wereusedassubstrateininvestigationofN?Ogenerationpathwayunderaerobiccondition.ResultsshowedthatN?OproductionwascloselyrelatedtothevariationofNO?-Nconcentration,whichindicatedthatN?Owasgeneratedinthedenitrificationprocess.Moreover,thedistributionofbacteriapopulationwasobservedbyFISHimagesandtheDOandN?Oconcentrationweredetectedbymicroelectrodetechnology.Resultsrevealedthattherewereanoxicmicroenvironmentsintheinneroflargesludgeflocs(particlesize>200um)inaerobicreactor.Denitrificationbacteriawereaccumulatedintheinnerarea,whereasAOBandNOBweredistributedevenlyfrominnertoouteroftheactivitysludgefloc.ThedistributionofDOandmicrobialpopulationwerebenefitforthedinitrificationreactions,whichledtoN?Oproductionandaccumulation.HighconcentrationoforganiccompoundsexistedinwaterwouldconsumelargeamountofoxygensurroundingthesludgeflocsandbroughtaboutlowDOintheinnerKeywords:wastewatertreatmentplant,greenhousegas,emissionfactors,characteristicsofVIVII致謝 1摘要 ⅢABSTRACT V 1 11.2研究的目的和意義 1 第二章文獻綜述 2.1溫室效應和溫室氣體 32.2污水處理過程中溫室氣體的產生和影響因素 5 6 7 2.3城市污水處理廠溫室氣體綜合研究 2.4分子生物學及微電極技術在溫室氣體研究中的應用 2.4.1nirS和nosZ編碼基因 2.4.2基因指紋圖譜技術 2.4.3基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法 2.4.4以rRNA為靶序列的探針雜交技術 2.4.5定量PCR分析方法 2.5存在問題 第三章材料與方法 3.1氣體采集方法 3.1.1污水廠靜態(tài)液面氣體采集 3.1.2污水廠曝氣液面氣體采集 3.1.3實驗室模擬裝置氣體采集 污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究VIⅢ3.1.4溶解性氣體的采集 3.2分析方法 3.4.4定量PCR 3.4.6微電極測定DO和N?O在污泥絮體中的分布 3.3計算方法 3.3.1氣體釋放量的計算 3.3.2溫室氣體的流動平衡 第四章城市污水處理廠溫室氣體的產生與逸散特征 4.1調查簡介 4.2Orbal氧化溝工藝 4.2.3各處理單元溫室氣體逸散情況 4.2.4進出水中溶解態(tài)溫室氣體 4.2.6溫室氣體的逸散和流動 4.2.7各處理單元的溫室氣體逸散量比例 4.2.8Orbal氧化溝工藝溫室氣體產生與逸散特點分析 4.2.9溫室氣體釋放因子 4.3倒置A2O工藝 4.3.3各處理單元溫室氣體逸散情況 4.3.5溫室氣體的逸散和流動 4.3.6各處理單元的溫室氣體逸散量比例 4.3.7倒置A2O工藝溫室氣體產生與逸散特點分析 4.4A2O工藝 4.4.7A2O工藝溫室氣體產生與逸散特點分析 4.5.2倒置A2O與A2o工藝 4.7本章小結 第五章A2O工藝N?O產生特征的研究 5.1A20模擬裝置 5.2不同DO濃度下N?O產生特征 5.2.2N?O的產生和逸散特征 5.2.3AOB和NOB含量的變化 5.3不同進水COD/TN條件下N?O產生特征 5.3.2N?O的產生和逸散特征 5.3.3AOB和NOB含量的變化 污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究X5.3.4nirS和nosZ編碼基因含量的變化 第六章好氧生物反應器中N?O產生途徑的研究 6.1好氧污水處理過程模擬裝置 6.2DO對N?O產生與逸散過程的影響 6.3不同底物好氧污水處理過程N?O產生比較 6.4活性污泥絮體內部環(huán)境 6.4.2DO在污泥絮體內的分布 6.4.3N?O在污泥絮體內的分布 6.5活性污泥絮體內部的微生物種群分布 6.6有機污染物含量對好氧污水處理過程N?O產生的影響 6.7pH對好氧污水處理過程N?O產生的影響 6.8本章小結 第七章結論與展望 1在城市污水處理過程中，有機物代謝的最終產物是CO?和H?O;厭氧生物反應過程會產生大量CH4;而生物脫氮過程有N?O產生。因此，城市污水處理廠被認為是重要的近些年，國內外針對城市污水處理過程中溫室氣體的產生已經進行了一些研究，掌握了一些污水處理廠溫室氣體釋放數(shù)據(jù)，但對不同工藝之間溫室氣體產生和釋放特征的差異還缺乏了解。此外，目前IPCC等機構用于評估城市污水過程溫室氣體釋放量的釋亟待加強對城市污水處理過程中溫室氣體產生量和產生規(guī)律的了解。因此，有必要通過對不同工藝的城市污水處理廠進行調查研究，分析不同工藝溫室氣體產生和逸散特點的差異，深入了解不同溫室氣體的產生機理和污水處理廠運行過程中對其產生的主要影響因素，為揭示城市污水處理廠溫室氣體釋放特征和實現(xiàn)處理過程減排提供基礎數(shù)據(jù)和理1.2研究的目的和意義本文通過對城市污水處理廠的調查研究，了解不同污水處理工藝中溫室氣體的產生環(huán)節(jié)和逸散特點，確定城市污水處理過程中溫室氣體的排放因子；利用微電極及分子生物學技術，分析實驗室模擬裝置中不同水質和運行條件對溫室氣體產生途徑及微生物種群結構和功能微生物含量的影響，揭示溫室氣體產生機理，為城市污水處理廠溫室氣體減排措施和相關政策的制定提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。本論文通過對實際城市污水處理廠三個不同污水處理工藝的調查研究，了解其運行過程中溫室氣體的產生特點和逸散規(guī)律，通過統(tǒng)計分析，得到了溫室氣體釋放因子。在此基礎上，對好氧過程中N?O的產生途徑和A20工藝中運行條件對N?O產生及其相關污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究2(1)城市污水處理廠溫室氣體產生與逸散特征研究。選擇北京市兩座城市污水處理廠中的三個典型污水處理工藝開展溫室氣體(CO?、CH?和N?O)釋放情況調查研究。了解不同工藝運行過程中溫室氣體產生和逸散特征，明確影響溫室氣體釋放量的主要因素，以及碳、氮元素在污水廠運行過程中的流向和分布規(guī)律，通過統(tǒng)計分析，確定不同(2)A2O工藝中N?O產生特征研究。在實驗室建立A2O工藝模擬裝置開展研究，采用定量PCR和FISH等分子生物學技術，考察不同進水COD/TN和好氧區(qū)DO條件下污水處理效果、N?O產生和釋放特征以及相關功能微生物和功能酶基因含量的變化，明確它們量之間的相互作用和影響規(guī)律。(3)好氧區(qū)N?O的產生途徑研究。對不同DO、pH和不同底物條件下好氧區(qū)N?O產生量及含氮污染物轉化過程進行分析，利用微電極技術對好氧污泥絮體內部DO和N?O的分布特點進行表征，結合熒光原位雜交(FISH)技術對好氧污泥絮體內部功能微生物的分布特點的觀察，揭示污水處理工藝好氧區(qū)N?O的產生途徑。第二章文獻綜述3第二章文獻綜述污水處理的目的是去除水體中可能危害環(huán)境的污染物。然而，城市污水廠去除污染物同時產生的溫室氣體(CO?、CH?和N?O)卻從另一方面增加了環(huán)境負擔，違背了人們進行環(huán)境治理的初衷。污水處理過程中，CO?來自微生物對污水中有機物的降解，主要產生于好氧處理過程；CH4在低溶解氧(DO)和高有機物濃度條件下，由產甲烷菌作用產生；N?O在生物脫氮過程中的硝化作用和反硝化作用中都能夠產生。目前，針對污水處理過程中溫室氣體產生的問題已經受到越來越多的關注，主要包括兩個方面：1、對污水廠運行過程中溫室氣體產生量的調查，獲得實際碳排放數(shù)據(jù)，為相關研究提供基礎支持；2、通過實驗室模擬裝置對溫室氣體產生機理的研究，為實際污水處理過程溫室氣體減排的優(yōu)化調控提供理論支持。溫室效應，是大氣保溫效應的俗稱。大氣能使太陽短波輻射到達地面，但地表向外放出的長波熱輻射線卻被大氣吸收，這樣就使地表與低層大氣溫度增高，因其作用類似于栽培農作物的溫室，故名溫室效應(IPCC,2007)。自工業(yè)革命以來，隨著世界經濟的迅速發(fā)展和社會的進步，人類向大氣中排入的二氧化碳等吸熱性強的溫室氣體逐年增加，大氣的溫室效應也隨之增強，地球大氣整體碳源的增加帶來的溫室效應導致全球平均氣溫逐年升高已引起全球氣候變暖海平面上升、極低冰雪面積減少等一系列嚴重問題(圖2-1),引起了全世界各國的廣泛關注。污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究4溫度(c1溫度(c1年地球地表溫度探測資料顯示，1995-2006年12年中，有11年位列最暖的12個年份之中。1906-2005年的100年期間，溫度上升了0.74℃。1956-2005年50年間的溫度上升速度為每十年0.13℃,幾乎是1906-2005年100年間的兩倍。海平面面積上升和冰雪面積減少都與溫度上升趨勢相一致。在1961至2003年期間全球平均海平面已以每年1.8毫米的平均速率上升，從1993至2003年，全球平均海平面已以每年大約3.1毫米的平均速率上升；1978年以來的衛(wèi)星資料顯示，北極年平均海冰面積已經以每十年2.7%的速率退縮。在南北半球，山地冰川和積雪平均面積已呈退溫室氣體是指大氣中促成溫室效應的氣體成分。溫室氣體的共同點，就在于它們能夠吸收紅外線。由于太陽輻射以可見光居多，這些可見光可直接穿透大氣層，到達并加熱地面。而加熱后的地面會發(fā)射紅外線從而釋放熱量，但這些紅外線不能穿透大氣層，因此熱量就保留在地面附近的大氣中，從而造成溫室效應。近年來最引人注意的全球氣溫上升，主要是由于人為作用，使大氣中溫室氣體的濃度極劇上升所致。為了應對全球氣候變化，限制人為溫室氣體的排放，《京都議定書》5規(guī)定了限制如下六種溫室氣體的排放(表2-1)(趙天濤，閻寧，趙由才，2009):表2-1《京都議定書》規(guī)定的六種溫室氣體特征種類增溫效應/%生命周期/a100年全球增溫潛勢CO?1N?O4氫氟烴(HFCs)全氟烴(PFCs)SF?及其他72.2污水處理過程中溫室氣體的產生和影響因素少量CO?少量CH?、CO?沉沙池進水圖2-2典型城市污水處理過程溫室氣體釋放示意圖Fig.2-2GreenhousegasemissionsSchematicdiagramofclassicmunicipalsewagetreatmentprocess6污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究1、產生途徑污水中的含碳有機物在污水處理過程中最終轉化為以下四個部分(阿爾瓦雷斯-科恩，威廉W.納扎洛夫莉薩，2006):1、被徹底氧化為CO?;2、被微生物同化(污泥);3、保持不變(不可被生物降解);4、轉化為其它有機物。其中絕大部分最終轉化為三種物質從質量看幾乎是等量存在的。表2-2列出了這三類物質的平均分子式、耗氧量、碳含量和氮含量。表2-2污水中碳水化合物、脂肪和蛋白質特性Table2-2Characteristicofcarbohydrate,fatandproteininwastewater基質平均分子式微生物好氧量(kgO?/kg)含碳量(%)含氮量(%)碳水化合物0油脂0蛋白質平均好氧過程中，不考慮硝化作用，微生物將生活廢水中的有機物氧化為CO?,有如下CigH?gO?N+17.50?+H?→18CO?+8H?O+NH?如上式所示，降解1kg的有機物需要消耗1.42kgO?,產生2.02kgCO2。通過好氧作用，廢水中的大部分有機物被氧化為CO?,這一過程產生的能量一部分被微生物利用，早在1987年，Bruins等對荷蘭所有的污水處理廠溫室氣體排放情況進行了調查研究，結果顯示，每降解1kgCOD會產生1.2kgCO?和17gCH?,荷蘭全國每年由污水N?O:8.3×10?kg/y(2.5×108kgCO?-eq/y)。對污水處理過程中每個處理單元CO?的產生量占產生總量的比例統(tǒng)計如下：7第二章文獻綜述表2-3污水處理過程各單元CO?產生量占總量的比例TablePercentageofCOp環(huán)節(jié)好氧段耗能沼氣使用沼氣逸出出水中殘留有機物的降解污泥處置百分比理工藝、服務人口12500、日均處理污水量4000t的污水處理廠所有處理環(huán)節(jié)產生CO?的情況進行了春夏兩季，為期六個月的調查，結果表明，在沉砂池(包括曝氣部分和非曝氣部分)中水溫與CO?的釋放通量成明顯的相關性，但好氧曝氣池的CO?釋放通量則與水溫沒有明顯線性關系。該污水廠CO?以人口為基準的排放因子為：35698gCO?/氣體產生量如表2-4所示：表2-4各單元CO?釋放量處理單元曝氣沉沙池沉沙池(非曝氣)CO?釋放量(g/y)根據(jù)污水處理過程中CO?的產生原理，其主要影響因素包括：污水處理效果和污泥齡。污水處理過程中產生的CO?直接來自污水中有機物的降解，污水處理效果直接影響有機物的降解量，因此，污水處理效果高低直接關系著CO?產生量的多少；污泥齡是影響污水處理過程中CO?產生量的另外一個重要運行參數(shù)，短污泥齡意味著更多的有機物轉化成生物質，以剩余污泥的形式排出廠外；長污泥齡則使污水中有機物更多的被徹底2.2.2CH4CH4主要產生于污水處理的厭氧工藝中。廢水厭氧工藝指各種沒有氧氣和硝態(tài)氮參與的廢水生物處理系統(tǒng)，利用兼性細菌與厭氧細菌，將復雜的有機化合物被降解、轉化8乙酸復雜有機物復雜有機物制國內外都有了較為深入和廣泛的研究，并且取得了許多研究成果(F.B.Green,L.Bernstone,T.LundquistetalVeekenHamelersMElFadelMassoud,2001;J.Li,Z.Zhang,Z.Li,etal.,2006;A.Guisasola,D.Haas,J.Keller,etal.,2008;L.Maya-Altamira,A.Baun,I.Angelidaki,etal.,2008;R.C.Wagner,J.M.Regan,S.E.Oh,etal.,2009)。第二章文獻綜述9CH?/kgBOD)最大的CH?產生能力；MCFj為CH?修正因子(比例)。公式中MCFj針對城市集中好氧污水處理廠的推薦值為0(管理完善)和0.3(管理不完善或超負荷運行),這意味著運行良好的城市污水處理廠運行過程中，幾乎沒有CH?的產CH?情況進行了詳細研究，發(fā)現(xiàn)該過程中能夠產生大量CH4,并且產生量隨著水力的溶解量能夠達到飽和狀態(tài)，在流動的過程以及進入污水廠后逐漸逸散，具有很強的不污泥法處理工藝，服務人口12500,日均處理污水量4000t的小型污水處理廠所有處理環(huán)節(jié)產生CH?的情況進行了為期六個月的調查。結果表明，在沉砂池(包括曝氣部分和非曝氣部分)中水溫與CH?的釋放通量成明顯的正相關。該污水廠以人口為基準的CH?其各污水處理單元全年CH4產生量如表2-5所示：表2-5各單元CH?釋放量處理單元沉沙池(非曝氣)CH?釋放量(g/y)Wang等(J.Wang,J.Zhang,H.Xie,etal.,2011)對我國濟南市的一座A2O工藝的城市污水處理廠進行了CH4產生的調查研究，發(fā)現(xiàn)各處理單元CH?產生量由大到小順序依gCH?/L,全年共釋放1.69×10?kgCH?,并且發(fā)現(xiàn)CH?的釋放通量在曝氣沉砂池和好氧池主要受DO濃度影響，在污泥濃縮池則與水溫顯著相關。污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究N?O俗稱笑氣，在城市污水處理過程中主要產生在脫氮過程的硝化和反硝化階段 溫室氣體中，N?O由于增溫潛勢最高(為CO?的296倍),產生量波動范圍較大，產生經典的水處理理論認為，硝化過程是NH?或NH?氧化物經由NO?被氧化為NO?化過程，但亞硝化過程非常復雜，對一些中間產物能否生成N?O還存在爭議 2010)。完成硝化作用的微生物多為專性自養(yǎng)微生物，硝化作用可分為兩個階段，分別程起到催化作用的酶有兩種：氨單加氧酶(ammoniamonooxygenase,AMO)和羥氨氧NOR)(D.J.Scala,L.J.Kerkhof,1998)。硝化反應過程所產生的N?O主要發(fā)生在氨及羥胺的氧化過程中，氨氧化菌在將NH?*氧化為NO?的同時，為避免NO?在細胞內積累，氨氧化菌會產生異構亞硝酸鹽還對于硝化過程中N?O的產生觀點比較一致是通過以下幾種途徑：1)羥胺(NH?OH)的氧化過程；2)硝?；姆巧锓磻?)硝化菌的反硝化作用；4)好氧反硝化菌；5)Xie,etal.,2011;P.Wunderlin,J.Mohn,A.Joss,etal.,2012)。厭氧微生物將NO?或NO?還原成N?O和N?的過程。酶催化對生物脫氮過程中N?O的第二章文獻綜述Nor)和氧化亞氮還原酶(nitrousoxidereductase,Nos)(R.Yu,M.J.Kampschreur,M.C.M.vanLoosdrecht,etal.,,2010;R.Bartossek,G.W.Nicol,A.Lanzen,etal.,2010;S.D.種中間物質，目前，對反硝化過程中N?O的產生主要有以下兩種解釋：一、反硝化菌發(fā)生Nos活性喪失，使得在第三個階段所產生的N?O不能夠進一步還原，導致N?O積累而從水體中逸出；二、部分反硝化細菌不具有Nos系統(tǒng)，其終產物僅為N?O。圖2-4生物氮循環(huán)示意圖FigSchematicdiagramofbiologicalnitrogencycle1:氨氧化細菌和氨氧化古菌(氨單加氧酶);2:氨氧化細菌和氨氧化古菌(羥氨氧化還原酶);3:硝化細菌(亞硝酸氧化還原酶);4:反硝化細菌(硝酸還原酶);5:氨氧化細菌和反硝化細菌(亞硝酸還原酶);6:氨氧化細菌和反硝化細菌(一氧化氮還原酶);7:反硝化細菌(氧化亞氮還原酶);monooxygenaseAOBandAOAhydroxylamineoxidoreductaseAenitrousoxidereductaseDenitrifyingbactnitritereductaseAOBandden(Nitrousoxidereductase);8:Anammoxbacteria.2、產生量和影響因素由于影響因素多，產生原因復雜，N?O的產生量在已有的研究中波動范圍較大，表2-6和表2-7分別顯示了實際污水廠和實驗室模擬中不同研究中N?O的產生情況。污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究表2-6實際污水處理廠N?O產生情況TableOemissioninfullscalewastewaN?O釋放量(%N負荷)工藝采樣頻率主要結論文獻出處0-14.6(平均0.6)40.6-25.3(平均3.5)0.01-1.8活性污泥法25座活性污泥法污水廠活性污泥法活性污泥法厭氧氨氧化硝化階段7座活性污泥法污水廠污水處理廠每周采樣P.Czepiel,P.Crill,R.持續(xù)15周Harriss,1995每個污水廠單獨N?O排放量隨TN負荷的Wicht,H.B.Maike,1995取樣增加而增加N?O排放量隨NO?-N和兩周一次，持續(xù)NO?"N濃度的增加而增E.Sümer,A.Weiske,G.一年加適當減少曝氣時間N?O排Y.Kimochi,Y.Inamori,M.在線監(jiān)測放量減少Mizuochi,etal..1998N?O排放量隨DO降低(厭M.J.Kampschreur,W.R.L.在線監(jiān)測氧階段)和NO?-N濃度的vanderStar,H.A.Wielders,增加而增加etal.,2008M.J.Kampschreur,N.C.G.一天三次五個月內采樣N?O產生量與NO?-N濃J.Foley,D.deHaas,Z.Yuan,20次好氧段比缺氧段產生更多每次持續(xù)采樣時的N?O,并且產生量與高J.H.Ahn,S.Kim,H.Park,et間大于24h濃度的NO?-N、NH?1-Nal.,2010和DO相關第二章文獻綜述表2-7實驗室模擬實驗N?O產生情況TableOemissioninlabscalewastewatertreatmentprocessesN?O釋放量(%N負荷)工藝采樣頻率主要結論文獻出處0.08-1.170.2-1.50.7-130.2-1(平均0.4)活性污泥法硝化階段處理人工廢水活性污泥法活性污泥法SBR反應器中連續(xù)厭氧-缺氧處理后行污泥法連續(xù)缺氧-好氧裝置處理人工廢水SBR活性污泥法好氧-缺氧連續(xù)運行處理人工廢水批量實驗(5h)硝化階段批量實驗(1d)硝化階段批量實驗(5h)硝化階段活性污泥法SBR連續(xù)運行處理人工廢水在線監(jiān)測每周取樣在線監(jiān)測在線監(jiān)測在線監(jiān)測在線監(jiān)測在線監(jiān)測N?O隨著NH?1-N負荷的波動以及NO?-N含量的增加而增加N?O隨著DO濃度的降低和污泥齡的降低而增加N?O隨著NO?-N含量的增加而增加，N?O可能是反硝化過程中聚糖菌的產物N?O產生量隨著進水鹽度的增加而增加好氧段產生的大量N?O可能是由于單一碳源而使細菌多樣性較低造成的N?O產生量隨著NO?-N濃度的增加而增加N?O產生量隨著DO濃度的降低和NO?-N濃度的升高而增加NodaN.,KanekoN.,R.J.Zeng,Z.Yuan,J.Keller,S.Tsuneda,M.Mikami,Y.R.Lemaire,R.Meyer,A.G.Tallec,J.Garnier,M.Gousailles,etal.,2006G.Tallec,J.Garnier,M.G.Tallec,J.Garnier,M.污水處理過程中N?O產生的主要影響因素：(1)DOGousailles,etal.,2006),濃度較低時會導致大量的N?O產生。在DO有限的條件下，污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究作為自養(yǎng)細菌的氨氧化菌能夠利用NO?-N作為電子受體完成將NH?1-N氧化為NH?OH的反應。在DO低于1mg/L時，以N?O形式釋放的N元素占到進水總氮(TN)負荷的10%(T.J.Goreau,W.A.Kaplan,S.C.Wofsy,1980)。硝化過程中DO對N?O產生的較大影響說明在城市污水處理廠需要對硝化池控制合適的條件，以防止出現(xiàn)低DO引起N?O的產生。另一方面，硝化過程中過高的DO也會通過污泥回流導致反硝化過程DO的升高，引起反硝化過程中N?O的產生。因此，通過對污水處理過程中N?O的在線監(jiān)控來提高曝氣輸送氧氣的效率以及檢驗水處理過程的運行狀況成為可能(BurgessJE.,Stuetz,RM.,MortonS.,etal.,2002;E.C.Sivret,W.L.Peirson,R.M.Stuetz,2008)。作用的幾種酶當中，氧化亞氮還原酶相比其他還原酶對DO更為敏感，當反硝化過程中J.Wang,etal.,2011)。(2)亞硝酸鹽在硝化過程和反硝化過程中亞硝酸鹽都會導致N?O的產生。硝化過程中亞硝酸鹽濃度的升高會在引起AOB通過反硝化作用(將亞硝酸鹽還原為N?O)產生N?O(B.B.Colliver,T.Stephenson,2000);而在反硝化過程中，亞硝酸鹽濃度的升高會導致反硝化效率的降低和N?O的積累(R.V.Schulthess,M.Kuhni,W.Gujer,1995)。N?O產生量對亞硝酸鹽濃度較為敏感，在人工添加10mg/LNO?-N的廢水處理系統(tǒng)中，根據(jù)DO的不(3)環(huán)境條件的突然改變許多研究者發(fā)現(xiàn)，污水處理過程中環(huán)境條件的突然改變會導致N?O產生量的升高，代謝作用需要對環(huán)境條件進行一定時間的適應，微生物群落對連續(xù)改變的環(huán)境條件適應過10個循環(huán)的底物添加馴化后NO?-N向N?O的轉化率從86%下降到了28%(S.在使用甲醛對細菌的馴化過程，以及利用一種氣升式生物膜反應器的反硝化過程中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象(J.MGarrido,JMoreno,RMendez-Pampn,etal.,1998)。第二章文獻綜述大部分由環(huán)境條件改變引起的N?O釋放量增加的現(xiàn)象都是在實驗室模擬試驗中被但是，由于對實際污水廠的N?O檢測數(shù)據(jù)有限，加上實際運行過程條件相對穩(wěn)定，運行條件改變對污水廠N?O整體產生量的影響還缺乏實證。污水處理過程中環(huán)境條件的改變的規(guī)模和程度由污水廠的工藝、處理單元容積、混合條件以及曝氣方式決定。氧化溝工藝就因為其特殊的充氧方式，使微生物相對其它工藝在好氧和缺氧條件間的轉換更加頻A20工藝),微生物在厭氧區(qū)和好氧區(qū)就會在穩(wěn)定環(huán)境條件下保持相對較長的停留時間。(4)COD/NKühni,W.Gujer,1995)。Hanaki等人在對COD/N為1.5、2.5、3.5和4.5的污水處理過程中發(fā)現(xiàn)，COD/N最低時，10%的進水TN轉化為了N?O(K.Hanaki,Z.Hong,T.Matsuo,1992)。Itokawa等人在利用間歇曝氣生物反應器處理高濃度有機廢水的試驗中發(fā)現(xiàn)，當進水COD/N低于3.5時，進水TN的20-30%轉化為N?O(H.Itokawa,K.Hanaki,T.養(yǎng)基中有機碳源受限時，TN的32-64%轉化為了N?O(S.Schalk-Otte,R.J.Seviour,J.G硝化過程中N?O釋放量的增加可能并不是由碳源缺乏直接導致的，而是由于碳源缺乏引起了NO?-N濃度的升高，進而引起了N?O產生量的增加(K.Hanaki,Z.Hong,T.Matsuo,1992)。Park等人發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為外加碳源，能將污水處理過程中N?O的產生量從而當進水COD/N達到10以上時，會引起好氧反硝化細菌的增加，進而導致N?O產生(5)細菌內部存儲化合物消耗有學者發(fā)現(xiàn)，聚糖菌(GAO,glycogenaccumulatingorganisms)作用的反硝化過程能夠導致N?O產生量的增加(R.J.Zeng,Z.Yuan,J.Keller,2003;R.Lemaire,R.Meyer,A.厭氧過程中都通過特殊的機制存儲有機碳以及其它有機物，這些物質在細菌體內的存儲所需的能量都來自的PHB的降解。生物除磷過程能夠對PAO進行篩選，但在較高溫度 污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究條件下GAO將不可避免的出現(xiàn)(C.M.Lopez-Vazquez,A.Oehmen,ChristineM,2009)。對于該過程中N?O產生量增加可能的解釋是，這些微生物在生長過程中，PHB的分解KDircks,M.C.MVanLoosdrecht,etal.,2002),這形成了反硝化酶系對電子的競爭，由于氧化亞氮還原酶對電子的競爭能力弱于一氧化氮還原酶，導致NO的還原速率高于Kuenen,etal.,2000)。因為PHB在多個污水處理工藝中都起到不可或缺的作用(M.C.MVanLoosdrecht,S.Salem,2006),因此，PHB與N?O產生量的聯(lián)系可能是綜合作用的結果，通過對反應過程水利條件的控制，能夠有效減少N?O的產生。Tabrez等人在反硝化細菌的純培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，在反硝化過程試驗中以PHB作為底物并沒有引起N?O產生量的增加，這是因為PHB在實驗過程中并不是細菌內部的存儲物質，而是以外加有機物的形式存在(S.T.Khan,A.Hiraishi,2001)。有研究顯示，歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonaseuropaea)在好氧條件下的純培養(yǎng)試驗中，N?O的產生量隨著pH的變化而變化，在pH=8.5時產生量最大，pH=6時產生現(xiàn)，N?O在pH低于6.8時產生(M.Thorn,F.Sorensson,1996)。Hanaki等在研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的實驗現(xiàn)象，在反硝化過程中，隨著反應系統(tǒng)的pH從8.5下降到6.5,N?O的產生量也隨之增加(K.Hanaki,Z.Hong,T.Matsuo,1992)。在實際污水廠污水處理的過程中，pH一般都保持在7到8之間，并且相對穩(wěn)定，因此，pH對N?O實際產生量的影響相對較弱。(7)間接影響N?O產生的因素一些因素并不能直接影響N?O的產生，但這些因素可以通過影響其他條件，間接的影響N?O的產生量(影響NO?-N濃度在此現(xiàn)象中最為常見)。較短的污泥齡、有毒化合物、低溫、高鹽度和高NH?'-N濃度都能夠導致N?O產生量的增加(B.B.Colliver,T.能導致NO?-N濃度的升高，進而引起N?O的產生。比較典型的實驗是Osada等人通過間歇曝氣的方法，降低了污水處理系統(tǒng)中NO?-N的積累，從而使N?O產生量從TN負荷的35%下降到1% 第二章文獻綜述2000;B.Schonharting,R.Rehner,J.W.Metzger,etal.,1998)。Tsuneda等人發(fā)現(xiàn)，在好氧-缺氧污水處理系統(tǒng)中，由鹽度能夠影響整個系統(tǒng)N?O產響(尤其是氧化亞氮還原酶)直接導致N?O產生量的增加。但是對于生活廢水處理過程甚至是工業(yè)廢水處理過程，鹽度的增加一般都不會達到Tsuneda等人試驗中的程度(S.Tsuneda,M.Mikami,Y.Kimochi,etal.,2005),因此，實際污水處理過程中由鹽度導致2.3城市污水處理廠溫室氣體綜合研究中產生的多種溫室氣體進行了綜合研究，不但觀察了三種溫室氣體各自的產生情況，還分析比較了在不同污水處理工藝中不同溫室氣體對溫室效應的貢獻。從工藝整體上，全面探討了污水處理過程可能的調整方式，以減少其運行過程中對溫室效應的貢獻總量。Sahely等(H.RSahely,H.LMacLean,H.DMonteith,etal.,2006)對2000年加拿大所有污水處理廠現(xiàn)場產生的溫室氣體(包括水處理過程、燃料消耗)和污水廠非現(xiàn)場上游消耗(包括燃料的加工運輸、發(fā)電過程)產生的溫室氣體進行了對比，結果表明：加Kong等(H.N.Kong,Y.Kimochi,M.Mizuochi,etal.,2002)對土壤滲濾池這種結構簡易并且應用廣泛(特別是在發(fā)展中國家)的污水處理工藝運行過程中的溫室氣體CH?和N?O進行了研究，結果表明，土壤滲濾池在中國和日本的運行過程中分別產生溫室氣N?O占污水中N負荷的2%-8%,在污水處理過程中如果能夠加強通風，使水槽中污水的氧化還原電位(ORP)保持在+200mv或者更高，能夠降低CH?和N?O的產生量的Cakir等(F.Y.Cakir,M.K.Stenstrom,2005)通過建立模型對比了厭氧和好氧工藝處理污水時溫室氣體的排放情況，考慮了剩余污泥的消化過程和溶解于水中的溫室氣體，污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究結果表明：當BOD小于300mg/L時好氧處理過程會釋放較少的溫室氣體，處理濃度更2.4分子生物學及微電極技術在溫室氣體研究中的應用描述的微生物物種數(shù)量僅占估計總量的1-5%,在污水生物處理過程中，這個比例也低于10%(L.D.Stetzenbach,M.P.Buttner,P.Cruz,2004)。自20世紀80年代末以來，用于NO?、NO?、NO和N?O(K.Chon,J.Chang,E.Lee,etal.,2011)。nir主要分布于化過程中的關健酶，作用于NO?,催化其轉化為NO;nos直接作用于N?O,催化N?O向N?轉化(圖2-4:反應7),與生物脫氮過程中N?O別由nirS和nirK基因編碼(A.B.Glockner,A.Jüngst,W.G.Zumft,Zumft中心。目前針對nos的研究主要利用nosZ作為靶基因，考察系統(tǒng)對N?O的還原能力以第二章文獻綜述G.Braker,J.Z.Zhou,L.Y.Wu,etal.,2000;B.Nogales,K.N.Timmis,DavidB.,2002;A.Prieme,G.Braker,J.M.Tiedje,2002;J.J.Rich,R.S.Heichen,P.J.Bottomley,etal.,2003;T.Yan,M.W.Fields,L.Wu,etal.,2003;DandieC.E.,BurtonD.L.,Zebarth,B.J.,etal.方面，Zhu和Chen在厭氧-好氧(低DO)SBR污水處理系統(tǒng)中，利用含有銅離子和丙酸的污泥發(fā)酵液作為外加碳源進行了對比試驗，結果顯示，添加了污泥發(fā)酵液的處理系2011),表明污水處理系統(tǒng)能夠通過人為措施增強nos的活性，達到減少N?O產生量的目的。Noda等人(N.Noda,N.Kaneko,M.Mikami,etal.,2003)對缺氧-好氧污水處理工藝的運行試驗中發(fā)現(xiàn)，短污泥齡和低DO都會引起N?O釋放量的增加，但對系統(tǒng)中微生物進行的分子生物學實驗結果并沒有發(fā)現(xiàn)與已知含有nosZ基因且N?O產生相關的細菌親緣關系接近的微生物種群，污水處理系統(tǒng)中能夠還原N?O的細菌多為不可培養(yǎng)細菌。目前，在污水處理領域針對nirS和nosZ基因與N?O產生的關系，以及兩種編碼基因與N?O產生量和環(huán)境條件之間的相互作用及影響的研究還亟待加強。基因指紋圖譜技術能夠了解復雜樣品中微生物群落的多樣性和變遷規(guī)律，尤其能夠在短時間內對大量環(huán)境樣品進行比較分析，其主要作用原理是通過各種分離技術評估段的完整性，并且不依賴于限制性內切酶試驗，因此比T-RFLP獲得了更加廣泛的關注 (W.Liu,T.L.Marsh,H.Cheng,etal,1997)。Fischer和Lerman最早提出了DGGE技術并成功首次將其應用于微生物生態(tài)學研究(G.Muyzer,E.C.D.Waal,A.G.Uitterlinden,1993),經過長期發(fā)展，目前該技術已經廣泛應用于環(huán)境微生物群落多樣性和種群動態(tài)監(jiān)測。然而，由于該方法同樣引入了由DNA提取和PCR擴增反應造成的實驗誤差，使污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法是應用DNA測序技術將克隆或分離的目標基因進行序列測定，并與數(shù)據(jù)庫中已有序列進行比較分析來確定微生物群落多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育關(ribosomalRNA,rRNA)基因序列研究各分類地位的微生物群落多樣性，可也限定某一個特定的功能基因研究特定微生物的種群組成。以rRNA為靶序列的熒光原位雜交技術(FISH)由于不需要對目標基因進行PCR擴增，因此避免了PCR過程中產生的定量誤差(R.AmannLudwig可在原位對環(huán)境樣品細胞進行核酸探針雜交，經熒光檢測體系在顯微鏡下對目標細菌細胞進行定性或相對定量分析。目前，利用共聚焦激光掃描顯微鏡和FISH技術結合使用，還可以對生物膜和活性污泥樣品中的細菌種群進行空間分布研究。物群落中的拷貝數(shù)或相對量。該技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，在每一輪循環(huán)后均檢測一次熒光信號的強度并記錄，通過對每個樣品到達指定熒光域值時所經歷的循環(huán)數(shù)的計算值，與標準曲線比較以獲得隨著微電極技術的飛速發(fā)展，已經有越來越多的微電極應用于了生物膜、顆粒污泥及活性污泥聚集體內部微環(huán)境特征的研究。結果表明，不同物質在膜或者絮體內部分布規(guī)律不同，且其分布特征受其外部宏觀環(huán)境條件的影響。由于活性污泥絮體具有不同于生物膜及顆粒污泥的特性，首先，其絮體粒徑相對較小，而且其對絮體外部環(huán)境的敏感性更高，導致活性污泥絮體內部微環(huán)境條件檢測一直較為困難。近幾年來，有學者設計了一種升流式測試小盒，在這個裝置中，污水通過蠕第二章文獻綜述脹污泥和未膨脹污泥絮體內部DO、NH?'、NO?濃度的分布特征(C.M.Santegoeds,G.Muyzer,D.deBeer,1998)。Schramm等在利用微技術能夠直觀反映N?O在污泥絮體中的濃度分布情況，在對N?O產生途徑的研究中有2.5存在問題(1)從以上研究現(xiàn)狀可以看出，盡管已經有學者對污水處理過程中溫室氣體的產污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究污染物濃度分布存在明顯差異，這些差異對微生物種群的分布以及N?O產生的關聯(lián)目前針對以上問題，本論文開展了相應研究。 第三章材料與方法釋放通量。1995),罩體頂部鏈接聚四氟乙烯管(O3mm),采集氣體時先將抽真空的采氣罩浸沒水面以下，待水中氣體逸散進入氣體采樣罩后轉移進入鋁箔氣體采樣袋。曝氣液面的氣(1)厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和二沉池頂部留氣體采樣孔，每次采集四個樣品，間隔時間3min,氣體樣品采用鋁箔氣體采樣(2)好氧區(qū)好氧池采集氣體時將好氧池頂部密封留直徑5mm采氣孔保持內外氣壓一致，由采氣孔直接連接采樣袋采集氣體樣品，好氧池N?O釋放通量E4(mg/m2min)的計算公式溶解態(tài)氣體的測定采用上部排空法。在密閉條件下，將污泥混合液經泥水分離后，加入0.15mL濃度為1000mg/L的HgCl?溶液以抑制殘余的微量微生物的活性，于水樣上部加入N?,振蕩0.5h后，測定上部氣體中氣體的濃度。根據(jù)所測氣體的濃度及亨利試驗中常規(guī)污染物COD、NH?1-N、NO?-N、NO?-N、TN、TP的分析采用《水和廢水監(jiān)測分析方法》中的標準方法(Y.Kimochi,Y.Inamori,M.Mizuochi,etal.,1998);WTW3110ORP測定儀。三種溫室氣體CO?、CH?和N?O都通過氣相色譜法測定，具體的檢測條件如表3-1分析目標GC色譜柱柱箱溫度檢測器載氣及流量CO?2m×φ3mm不銹鋼填充柱，Agilent6890NporapakT,80-100目He,30mL/min2m×p2mm不銹鋼填充柱，Agilent6890NporapakQ,60-80目HP-Chemistation3m×φ2mm不銹鋼填充柱，5890porapakQ,80-100目Ar-CH4(10%),試驗中活性污泥絮體內部功能菌群的分布采用熒光原位雜交(FISH)技術進行研究。本論文選用表3-2中所列的探針、靶序列標記熒光素及雜交條件進行熒光原位雜交。Ntspa662和Nsrl156為硝化螺菌屬特異探針。熒光染料TexasRed標記探針EUB338,激發(fā)/發(fā)射波長為583/603nm,呈紅色；熒光染料FITC標記探針Nit3、Ntspa662和Nsr1156,激發(fā)/發(fā)射波長為495/520nm,呈綠色；熒光染料Cy5標記探針Nso190和Nsol225,激發(fā)/發(fā)射波長為643/667nm,呈橙黃色；熒光染料Cy3標記探針DnB1,激發(fā)/發(fā)射波長為488/570nm,呈藍色。多重染色后在共聚焦激光掃描電鏡TCSSP5(Leica,德國)的同一視野下進行觀察，并采集圖像分析其特異功能細菌的分布特征，同時利用 污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究探針序列(5'-3')標記熒光素甲酰胺濃度(%)EUB338GCTGCCTCCCGTAGGAGTTexasRed全細菌Nit3CCTGTGCTCCATGCTCCGFITCNtspa662GGAATTCCGCGCTCCTCTFITCNsrl156CCCGTTCTCCTGGGCAGTFITCNsol90CGATCCCCTGCTTTTCTCCCy5氨氧化菌Nsol225CGCGATTGTATTACGTGTGACy5氨氧化菌DnB1CGGGAGGCAGCAGTCy3反硝化細菌1992)提出的雜交程序，同時參考其它文獻，采用以下雜交步驟：(1)樣品固定樣品固定的目的是最大限度地保存細菌內的RNA,使細菌細胞壁具有良好的通透輕微清洗3次，加入3倍體積4%多聚甲醛，4℃過夜固定后，用1×PBS輕微清洗3次。(2)樣品預處理將固定好的樣品涂布在預處理過的FISH雜交玻片上，自然風干后，分別用50%、80%和100%乙醇進行濃度梯度脫水，每個梯度各3min。(3)原位雜交(4)多余探針清洗每一步雜交結束后，先用48℃預熱的雜交清洗緩沖液輕微沖洗雜交玻片，然后將第三章材料與方法(6)圖像分析采用CLSM設備自帶的圖像分析軟件對熒光原位雜交圖像進行，以熒光強度或面積為表征指標，分析被檢菌在全菌中的分布、存在率和相對含量。采用SYBRGreenI熒光染料嵌合法，分別以細菌基因組DNA和大腸桿菌基因組曲線，并利用標準曲線對各樣品進行絕對定量分析。具體試驗方法如下：(1)構建DNA標準品將目的基因的片段TA克隆到pMD18-T載體(TaKaRa,大連寶生物)上，使用TaKaRa質粒純化試劑盒進行質粒純化，構建好的質粒分別采用EcoRI限制酶(nirS、nosZ)、BamHI限制酶(總細菌)進行線性化處理，PCI、CI抽提、乙醇精制后得到標準品。(2)標準曲線繪制copy/ul)作為模板進行RealTimePCR反應，制作標準曲線。反應中所使用的引物如表3-3中所示。污水處理過程中溫室氣體的產生與逸散特征研究引物名稱序列(5'-3')GC(%)擴增長度(bp)nirS-F1TACCACCCCGAACCGCGCGTnirS-F2TACCACCCCGAGCCGCGCGTnirS-F3TACCACCCGGAACCGCGCGTnirS-F4TACCACCCGGAGCCGCGCGTnirS-R1GCCGCCGTCATGAAGGAA61.11nirS-R2GCCGCCGTCATGCAGGAA66.67nirS-R3GCCGCCGTCATGGAGGAA66.67nosZ-FAGAACGACCAGCTGATCGACATCCATGGTGACGCCGTGGTTG61.90總菌-FATGGCTGTCGTCAGCT總菌-RACGGGCGGTGTGTAC66.672μl模板DNA,0.25μl引物，總反應體系為25μl。AOB菌群和總細菌的反應條件為95℃預變性30s,然后在95℃變性5s、65℃退火30s的條件下進行45個循環(huán)的反應，而NOB菌群的反應條件為95℃預變性30s,然后在95℃變性5s、63℃退火30s的條件下進行45個循環(huán)的反應，反應結束后利用儀器自帶軟件進行標準曲線的繪制。(3)樣品檢測樣品檢測方法同標準曲線繪制方法，不同的是反應體系中模板為每個樣品的DNA(4)樣品中特定菌群的定量計算依據(jù)標準曲線，分別對不同樣品中各類細菌DNA的含量進行計算。為保證活性污泥絮體粒徑測試的準確性，本研究采用便攜式激光粒度儀(LISST-PORTABLE)對污泥絮體進行即時測定。第三章材料與方法3.4.6微電極測定DO和N?O在污泥絮體中的分布本研究采用微電極技術，分別監(jiān)測了活性污泥絮體內部DO和N?O的濃度分布變化，以此來表征絮體內部的微環(huán)境特征。試驗中采用的微電極為Clark型微電極(Unisense,應時間小于5s。所有微電極均通過顯微操縱器控制其測試步進為25μm?；钚晕勰嘈躞w懸浮于一個上流式有機玻璃盒中固定的尼龍網上，如圖3-1所示。小盒中污水、DO濃度等均與實驗室活性污泥反應器內相似。FigDiagramofmicroelect溫室氣體釋放量G(mg/d)的計算公式為：G?=E2A?×60×24G?、G?、G?和G4分別為污水廠靜態(tài)液面、污水廠曝氣液面、A2O模擬裝置靜態(tài)液面處理單元和A2O模擬裝置好氧區(qū)N?O產生量。E?、E?、E?和E4分別為污水廠靜態(tài)液面、污水廠曝氣液面、A2O模擬裝置靜態(tài)液面處理單元和A2O模擬裝置好氧區(qū)N?O逸態(tài)液面處理單元和A20模擬裝置好氧區(qū)液面面積。 二沉池Q沉砂池EocQQEssTEssTEEar沉砂池好氧區(qū)缺氧區(qū)厭氧區(qū)40%QQQ沉砂池食好氧區(qū)厭氧區(qū)QQQ圖3-2三種工藝運行過程中溫室氣體的流動與平衡Fig.3-2Flowandbalanceofgreenhousegasesinthetreatmentprocessofthreeprocesses第三章材料與方法