QIAGEN試劑盒提取RNA說明書中文翻譯

1:細菌的溶菌酶破碎2:細菌的溶菌酶破碎和機械破碎3:細菌的機械破碎4:細菌的溶菌酶裂解和蛋白酶K的消化5:細菌的溶菌酶裂解、蛋白酶K的消化及機械破碎6:固體培養(yǎng)基細菌的裂解7:使用RNeasyMiniKit從細菌溶解物中提純總RNA。8:使用RNeasyMidiKit從細菌溶解物中提純總RNA。章節(jié)說明該手冊含有兩種不同類型方案。我們提供了多種方案，其中方案1-6是針對制備細菌溶解物，方案7-8是針對如何從細菌溶解物中提取全RNA。你需要在方案1-6中選擇一種操作，而后在方案7-8中任選其一。制備細菌溶解物的各個方案都介紹了破碎細菌時如何固定RNA。如何選擇不同的實驗方案由細菌細胞壁的穩(wěn)定性所決定。細菌細胞壁的穩(wěn)定性受多個因素影響，包括細菌種類、生長階段和培養(yǎng)基的成分。細菌必須完全破碎以確保RNA的有效提取。制備細菌溶解物的各個方案都包含了不止一步?！雒赶杭毦毎诳梢员蝗芫高M行消化（例如溶菌酶、溶葡球菌酶）。我們認為溶菌酶的作用對于所有的革蘭氏陽性、陰性細菌均是有效的?！龅鞍酌窴消化:在復雜培養(yǎng)基上生長的細菌大部分蛋白質可以被蛋白酶K消化以提高RNA的純化率。我們認為蛋白酶K對于可在復合培養(yǎng)基中生長的細菌均是有效的。蛋白酶K常常用于提高革蘭氏陽性細菌RNA。另外，若從大量原材料中提取RNA，蛋白酶K可以有效提高RNA產(chǎn)率?！鰴C械破碎：細菌細胞壁的機械破碎可以使用組織研磨機和玻璃微珠。機械破碎法對于絕大多數(shù)的細菌來說都是適用的。機械破碎法與酶消化法相結合可以極大程度的提高RNA產(chǎn)率。盡管本手冊中的機械破碎方案均為使用組織研磨機，但采用其他的破碎方法是完全可行的?？紤]到細菌種類的多樣性以及培養(yǎng)條件的多樣性，細菌溶解物的制備方案（方案1-6）必須謹慎選擇。在第10頁中介紹了制備細菌溶解物的不同方案，第11頁（表格一）則提供了這些方案概況以便于參考選擇。方案一：細菌的酶消化該方案僅涉及到酶消化。我們建議該方案適用對象為生長在基本培養(yǎng)基的為短世代的革蘭氏陽性細菌方案二：細菌的酶消化以及機械破碎該方案涉及到在機械破碎過程中使用酶進行消化。我們建議該方案的使用對象為生長在基本培養(yǎng)基上的革蘭氏陰性細菌和易于破碎的革蘭氏陽性細菌。方案三：細菌的機械破碎該方案僅涉及到機械破碎，廣泛適用各類細菌，但是使用該方案相比于其他方案會取得更低的RNA產(chǎn)率。方案四：細菌的酶消化和蛋白酶K處理該方案主要是溶菌酶與蛋白酶K的共消化。我們建議該方案適用于生長在復雜培養(yǎng)基的革蘭氏陰性細菌和生長在基本或復雜培養(yǎng)基上的革蘭氏陽性細菌。方案五：細菌的酶消化、蛋白酶K消化和機械破碎該方案主要是在機械破碎過程中使用酶消化、蛋白酶K消化共處理。我們建議該方案適用于生長在基本或者復雜培養(yǎng)基上的難以破碎的革蘭氏陽性細菌。方案六：固體培養(yǎng)基細菌的破碎該方案適合生長在固體培養(yǎng)基上的細菌。細菌細胞可以通過溶菌酶的消化并同時加入蛋白酶K或者使用機械破碎。方案七：使用RNeasyMiniKit從細菌溶解物中提取全RNA該方案就使用RNeasyMiniKit從每份樣品中提出最高100用的RNA。該方案所需使用的細菌溶解物可以通過方案1-6中的其中一個進行制備。方案八：使用RNeasyMidiKit從細菌溶解物中提取全RNA該方案就使用RNeasyMidiKit從每份樣品中提出最高1mg的RNA。方案所需使用的細菌溶解物可以通過方案1-6中的其中一個進行制備。Table1.OverviewofProtocolsforPreparingLysatesofBacterialCellsbacteriaCultureProtocolnumberEnzymoticlysisProteina&eKdigestionMechanicaldisruptionGram-Minimal1*YesNoNonegativemedia2YesNoYesGram-Complex4YesYesNonegativemediaGram-Minimal2-YesNoYespositivemedia4YesYesNo5YesYesYesGram-Complex4:YesYesNopositivemedLa5YesYesYesMixtureofMinimalor3NoNoYesdifferentcomplexspecie5mediaGram-SolidmediaYesOptionalOptionalnegativeorGrampositive注意：對于某些種類的細菌或者培養(yǎng)條件而言，使用苯酚-異硫氰酸胍基礎裂解緩沖液可以提升RNA的產(chǎn)率。該手冊的附錄部分含有描述通過與RNeasyLipidTissueMiniKit（包括了苯酚-異硫氰酸胍基礎裂解緩沖液）結合使用的RNAprotectBacteriaReagent來固定并提取細菌RNA。附錄C（第41頁）是為大多種類細菌而制備的方案，介紹了溶菌酶和自行選擇的蛋白酶K消化通過加熱QIAzol反應液和RNA提取。附錄D（第44頁）是為某些特定革蘭氏陽性細菌制備的方案，介紹了在加熱的QIAzol反應液中的溶菌酶消化、蛋白酶K消化、機械破碎，而后進行RNA提取。實驗人員需自備的儀器和試劑因實驗常接觸化學藥劑，請穿戴實驗服、一次性手套和護目鏡。更多信息，請查詢MSDSs，可通過供貨商購買。方案須知■滅菌的，無RNase槍頭■恰當型號的離心管和微型離心機或者適當轉子的離心機■一次性手套■渦旋器■震蕩孵育箱涉及酶解的方案(第十一頁，表一)■胞壁質酶或者合適的溶解酶■配置TE緩沖液所需的Tris和EDTA涉及蛋白酶K消化的方案(第十一頁，表一)QIAGEN蛋白酶K涉及機械破碎的方案(第十一頁，表一)■組織破碎器■玻璃微珠涉及RNeasyKits的方案14.3Mb-巰基乙醇RNeasyMiniKit,RNeasyMidiKit,RNeasyProtectBacteriaMiniKit,或者RNeasyProtectBacteriaMidiKit■乙醇(96-100%)、乙醇(80%)或者乙醇(70%)■建議：RNase-FreeDNaseSet重要事項最佳的培養(yǎng)條件為確?；虮磉_的準確性以及可重復性，以下幾點需實驗人員注意■培養(yǎng)基：我們建議使用基本培養(yǎng)基，因為基本培養(yǎng)基成分更加明確，相比于復合培養(yǎng)基具有更少的可變因素。■收集細胞的時間：細胞應當在對數(shù)中期進行收集。在這一階段，培養(yǎng)條件處于穩(wěn)定狀態(tài)。細胞的營養(yǎng)也沒有消耗，因為高度的新陳代謝活動使RNA也處于極高的水平。另外，當細菌細胞的生長達到穩(wěn)定期，細胞壁將變得難以滲透進去，這回在RNAprotectBacteriaReagent固定RNA的過程中降低滲透速率及效果。RNA產(chǎn)率受到細菌細胞世代時間很大影響，我們因此建議使用新鮮培養(yǎng)基。正確選擇起始材料的使用量我們使用RNeasyKits從細菌溶解物中提取RNA，起始材料的使用量十分重要，需仔細計算。有兩個因素需要考慮：RNeasy離心柱的RNA結合力：RNeasyMinispincolumn最高生產(chǎn)量為每份100昭，RNeasy7070Midispincolumn為每份1mg?！鯮NAprotectBacteriaReagent在細胞培養(yǎng)過程中的作用效果以及可以起到有效溶菌作用的RLT體積：每RNeasyMini離心柱最多為7.5x108細胞數(shù)目，每份RNeasyMidi離心柱為5x108-7.5x109細胞數(shù)目。細胞數(shù)目最大值是以在LB培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌為參考。因為不同種類的細菌會表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，也可能因培養(yǎng)條件不同而產(chǎn)生區(qū)別，所以細胞最大數(shù)目常常是有所差別的。Theselimitingfactorsareillustratedinthefollowing2examples,whichshowthecalculationoftheamountofE.colitoapplytoanRNeasyMinispincolumn:相關的因素將在以下的兩個例子中闡述,主要是介紹了使用大腸桿菌E.coligrowninRNAyieldapproximately40|igper7.5x108cells.Uptominimalmedium7.5x108cellscanbeused(useofhighernumbersofcellsresultsininefficientlysisandreducedyield).E.coligrowninRNAyieldapproximately120|igper7.5x108cells.UptoLBmedium6x108cellscanbeused(100|igRNAisthemaximumbindingcapacityoftheRNeasyMinispincolumn).Table2showsthetypicalRNAyieldsfrombacterialcellsgrownindifferentculturemedia.Note:IftheRNAbindingcapacityoftheRNeasyspincolumnisexceeded,orifcelllysisisincompleteduetotheuseofexcessstartingmaterial,theyieldandpurityofthepurifiedRNAwillbesignificantlyreduced.BacterialspeciesulturemediumNo.cellsRNAyield(^g)iE.coliMinimalmedium5x10825E.coliLB5x108B.subtilisMinimalmedium1x1088B.subtilisLB1x10815Table2.TypicalYieldsofTotalRNAfromTwoBacterialSpeciesGrowninDifferentCultureMedia**BacterialcellsdisruptedaccordingtoProtocol1.tWerecommendminimalmediaforgrowingbacteria.iYieldscanvaryduetofactorssuchasgenerationtimeandgrowthconditionsused.Inaddition,followingtheprotocolsformechanicaldisruptionofcells(Protocols2,3,and5)mayincreaseyields.SincetheRNeasyprocedureenrichesformRNAandotherRNAs>200nucleotides,thetotalRNAyielddoesnotincludequantitativeamountsof5SRNA,tRNA,andotherlow-molecular-weightRNAs,whichmakeup1520%oftotalcellularRNA.IfyourstartingmaterialisneitherE.colinorB.subtilisandyoudonotknowitsRNAcontent,werecommendusingnomorethan2x108cellsperRNeasyMinispincolumnor2x109cellsperRNeasyMidispincolumninthefirstpurificationprocedure.DependingonRNAyieldandpurity,itmaybepossibletoincreasethenumberofcellsinsubsequentprocedures.TooptimizeRNAyields,werecommendperformingpilotexperimentsinwhichRNAispurifiedfromdifferentamountsofcells.QuantifyingbacterialcellsBacterialgrowthisusuallymeasuredusingaspectrophotometer.However,itisverydifficulttogivereliablerecommendationsfortherelationshipbetweenODvaluesandcellnumbersinbacterialcultures.ODreadingsareinfluencedbyfactorssuchasbacterialspeciesandphysiology,sinceODreadingsmeasurelightscatteringratherthanabsorption.Measurementsoflightscatteringdependonthedistancebetweenthesampleandthedetector,andreadingsfromdifferenttypesofspectrophotometerthereforevary.Furthermore,differentspeciesshowdifferentODvaluesatcertainwavelengths(e.g.,600nmor436nm).Bacterialphysiologycanbeinfluencedbyvariousfactors(e.g.,culturemedia,temperature,andshakerspeed).WethereforerecommendcalibratingyourspectrophotometerbycomparingODreadingsatappropriatewavelengthswithviablecelldensitiesdeterminedbyplatingexperiments.*ODreadingsshouldbebetween0.05and0.3toensurereliability.SampleswithODreadingsabove0.3shouldbedilutedsothattheODreadingsfallwithinthisrange;thedilutionfactorsareusedwhencalculatingthenumberofcellsperml.Thefollowingcalculationmaybehelpfulasaroughguide.AnE.colicultureof1x109cells/mlisdiluted1:4,andgivesOD600readingsof0.25withaBeckmanDU?-7400spectrophotometeror0.125withaBeckmanDU-40spectrophotometer.ThesecorrespondtocalculatedODreadingsof1.0or0.5,respectively,for1x109cells/ml.HandlingandstoringstartingmaterialRNAprotectBacteria