水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測

水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測（一） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測定原理和測定意義。（2）學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。（3）學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測方法。（二） 實(shí)驗(yàn)原理水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境。各種天然水中常含有一定數(shù)量的微生物。水中微生物的主要來源有：水中的水生性微生物（如光合藻類）、來自土壤徑流、降雨的外來菌群和來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動(dòng)物的傳染性排泄物。水的微生物學(xué)的檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每mL不超過100個(gè)。所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌落（colony-formingunit，cfu）數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g（mL）。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。所謂大腸菌群，是指在37°C24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)（MPN）表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可隨人畜排泄物進(jìn)入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，國際上已公認(rèn)大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。（三）實(shí)驗(yàn)器材（1） 菌落總數(shù)的測定：1） 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水。2） 器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。（2） 大腸菌群的測定；1） 培養(yǎng)基：乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨20g，豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g，乳糖10g，0.04%漠甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。制法：將蛋白胨、膽鹽從乳糖溶于水中，校正？田加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一個(gè)杜氏小管，l15C滅菌15min。雙倍或三倍乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，乳糖10g，KHP02g，2%伊紅水溶液20Ml，0.65%美藍(lán)水溶液lOmL，瓊脂17g，水1000mL，pH7.1。制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶于水中，校正pH后分裝.121C滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并熔化瓊脂，冷至50-55C，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平板。乳糖發(fā)酵管：除不加膽鹽外.其余同乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基。2） 器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。（四）實(shí)驗(yàn)方法（1） 水樣的采集：1） 自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。2） 池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內(nèi)檢測的，需放入冰箱中保存。（2） 細(xì)菌總數(shù)的測定：1） 水樣稀釋及培養(yǎng)：按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋：⑦根據(jù)對水樣污染情況的估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度（飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水一被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度），吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)重復(fù)。將熔化后保溫度45C的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL，并趁熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±1h后取出，計(jì)算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。2） 計(jì)算方法：作平板計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。3） 計(jì)數(shù)的報(bào)告：平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。稀釋度的選擇：應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例1）。若有兩個(gè)稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若比值大于2,則報(bào)告其中較小的數(shù)字（1例2、例3）。若所有稀釋度的平均菌落均大于300,則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（1例4）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（1例5）。若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例6）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例7）。細(xì)菌總數(shù)的報(bào)告：細(xì)菌的菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來表示，如表1“報(bào)告方式”一欄所示。（3）大腸菌群的測定（多管發(fā)酵法）: 表1稀釋度的選擇及細(xì)菌數(shù)報(bào)告方式 稀釋度及菌落數(shù) 稀釋度之落總數(shù)/（cfu/g或c方栽L0菌落總數(shù)）/（cfu/mL或cf10-110-210-31多不可計(jì)16420-1640016000或1.6X1042多不可計(jì)295461.63775038000或3.8X1043多不可計(jì)271602.22710027000或2.7X1044多不可計(jì)多不可計(jì)313-313000310000或3.1X105527115-270270或6000-<10<107多不可計(jì)30512-3050031000或3.1X1041） 生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)：初步發(fā)酵試驗(yàn)：在2個(gè)各裝有50mL的3倍濃縮乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)液（可稱為三倍乳糖膽鹽）的三角瓶中（內(nèi)有倒置杜氏小管），以無菌操作各加水樣100mL。在10支裝有5mL的三倍乳糖膽鹽的發(fā)酵試管中（內(nèi)有倒置小管），以無菌操作各加入水樣10mL。如果飲用水的大腸菌群數(shù)變異不大，也可以接種3份100mL水樣。搖勻后，37°C培養(yǎng)24h。平板分離：經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB培養(yǎng)基）上，37C培養(yǎng)18—24h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：將革蘭氏陰性無芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落1—3個(gè)，37C培養(yǎng)24h，如果產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。報(bào)告：根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的復(fù)發(fā)酵管的陽性管數(shù)，查表107-2（或表107-3），報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（MPN）。2） 水源水的檢驗(yàn)：用于檢驗(yàn)的水樣量，應(yīng)根據(jù)預(yù)計(jì)水源水的污染程度選用下列各量。嚴(yán)重污染水：1，0.1，0.01.0.00lmL各1份。中度污染水：10.1，0.1，0.01mL各1份。輕度污染水：100，10，1，0.1mL各l份。大腸菌群變異不大的水源水：10mLl0份。表2大腸菌群檢索表（飲用水）012 備注每升水樣中大腸菌群數(shù)0<341113818271327311183841424525183070總量300mL(100mL2份，6223692727431208315116193660230104069>230 表3大腸菌群數(shù)變異不大的飲用水 陽性管數(shù) 0 12 3種水樣總量300mL（3份100mL

每升水樣中大腸菌群數(shù)<3411>18表4大腸菌群檢索表（嚴(yán)重污染水）接種水樣量/mL 水樣中大腸菌群數(shù) 備注10.10.010.001____<900___+900__+_900_+__950__++1800_+_+1900_++_2200+___2300量為1.111(1,0.1,0.01,0._+++2800 份)+__+9200+_+_9400+_++18000++__23000++_+96000+++_238000++++>238000 表5大腸菌群檢索表（中度污染水） 接種水樣量/mL 水樣中大腸菌群數(shù) 備注1010.10.01____<90___+90__+_90_+__95__++180_+_+190_++_220 接種水樣總量+___230 為11.11_+++280 (10,1,0.1,0.01mL+__+920 各一份）+_+_940+_++1800++__2300++_+9600+++_23800++++>23800表6大腸菌群檢索表（輕度污染水）接種水樣量/mL 水樣中大腸菌群數(shù) 備注1001010.1____<9___+9__+_9_+__9.5__++18_+_+19 接種水樣總量為_++_22 (100,10,1,0.1mL各+___23_+++28+__+92+_+_94+_++180++--230++-+960+++-2380+++ +>2380表7大腸菌群變異不大的水源水陽性管數(shù)01234 5 67 8910每升水樣中大腸菌群數(shù)<1011223651 69 92120 160230>230備注接種水樣總量100mL（10mL10份）操作步驟同生活用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)注意，接種量1mL及1mL以內(nèi)用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管；接種量在1mL以上者，應(yīng)保證接種后發(fā)酵管（瓶）中的總液體量為單倍培養(yǎng)液量。然后根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)，查表107-4、表107-5、表107-6或表107-7,報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（MPN）。附：濾膜法濾膜法所使用的濾膜是一種微孔濾膜。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的濾器中，經(jīng)過抽濾，細(xì)菌即被均勻地截留在膜上，然后將濾膜貼于大腸菌群選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。再鑒定濾膜上生長的大腸菌群的菌落，計(jì)算出每升水樣中含有的大腸菌群數(shù)（MPN）。（1） 準(zhǔn)備工作：1） 濾膜滅菌：將3號濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中蒸煮滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需換無菌水洗滌2-3次，以除去殘留溶劑。2） 濾器滅菌：準(zhǔn)備容量為500mL的濾器，用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用121°C高壓滅菌20min。3） 培養(yǎng)：將品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基放入37C培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫30-60min。（2） 過濾水樣：1） 用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將祖糙面向上貼放于已滅菌的濾床上，輕輕地固定好濾器漏斗。水樣搖勻后，取333mL注入濾器中，加蓋，打開濾器閥門，在—50kPa壓力下進(jìn)行抽濾。2） 水樣濾完后再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用無菌鑷