《血紅蛋白的提取和分離》

血紅蛋白的提取和分離了解從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法理解凝膠色譜法的原理和方法1.凝膠色譜法的原理和方法2.樣品的預(yù)處理、色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填一、凝膠色譜法1．概念也稱作

法，是根據(jù)

的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，凝膠實(shí)際上是一些微小的

球體。分配色譜相對(duì)分子質(zhì)量多孔多孔球體多糖類化合物貫穿的通道(2)分離原理：相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入

的通道，路程

，移動(dòng)速度較慢；

的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程

，移動(dòng)速度較快。凝膠內(nèi)部較長(zhǎng)相對(duì)分子質(zhì)量較大較短二、緩沖溶液1．作用在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能抵制

對(duì)溶液pH的影響，維持

基本不變。2．配制通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成，調(diào)節(jié)緩沖劑的

就可以制得在

范圍內(nèi)的緩沖液。外界酸和堿pH使用比例不同pH三、電泳1．概念帶電粒子在

的作用下發(fā)生

的過(guò)程。2．原理(1)許多重要的生物大分子，如

、

等都具有

的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上

或

。(2)在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著

移動(dòng)。(3)電泳利用了待分離樣品中各種分子

以及分子本身的

、

的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的

，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。電場(chǎng)遷移多肽核酸可解離正電負(fù)電與其所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度四、血紅蛋白提取和分離1．樣品處理及粗分離(1)紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除

。(2)紅細(xì)胞的釋放：在

和

作用下，借助磁力攪拌器的

作用，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：離心(以2000r/min速度，離心10min)→觀察到試管中的溶液分4層，從上往下依次為：雜蛋白蒸餾水甲苯攪拌第1層：

的甲苯層。第2層：

的沉淀層——

薄層固體。第3層：

的水溶液——

透明液體。第4層：其他雜質(zhì)的

色沉淀物。將液體用

過(guò)濾，除去

，于

中靜置片刻后，分出下層的

液體。無(wú)色透明脂溶性物質(zhì)白色血紅蛋白紅色暗紅濾紙脂溶性沉淀層分液漏斗紅色透明(4)透析——粗分離。①過(guò)程：取1mL的

溶液裝入

中，將其放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol·L－1的

中(pH＝

)，透析12h。②原理：透析袋能使

自由進(jìn)出，而將

保留在袋內(nèi)。③目的：去除

。血紅蛋白透析袋7.0磷酸緩沖液小分子大分子相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)2．凝膠色譜操作——純化(1)

的制作。(2)凝膠色譜柱的裝填：①裝柱前要將色譜柱

在支架上。②裝柱前需根據(jù)色譜柱的

計(jì)算所需要的

。③注意色譜柱內(nèi)不能有

存在，否則重裝。(3)樣品的

和

：在蛋白質(zhì)分離過(guò)程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過(guò)程中的移動(dòng)情況，如果血紅蛋白的紅色區(qū)帶

地移

動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。凝膠色譜柱垂直固定內(nèi)體積凝膠量氣泡加入洗脫均勻一致3．純度鑒定——SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷

的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定方法中使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。純化1．讀教材P64～66[基礎(chǔ)知識(shí)]的相關(guān)內(nèi)容，歸納并回答下列問(wèn)題。(1)觀察教材P65圖5－13，試從物質(zhì)大小、運(yùn)動(dòng)方式、路程、速度等方面填寫下表，以分析總結(jié)凝膠色譜法的原理。(2)交流并分析為什么使用緩沖液？提示：生物體內(nèi)進(jìn)行的各種化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，緩沖液能夠抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的影響。使用緩沖液是為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的pH。(3)為什么電泳能夠?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)得以分離？提示：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力方向、大小、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。(4)試分析在瓊脂糖凝膠電泳法和聚丙烯酰胺凝膠電泳中，決定各種分子在電場(chǎng)中的遷移速度的因素分別是什么？提示：瓊脂糖凝膠電泳：各種分子的帶電性質(zhì)差異、分子大小、形狀；聚丙烯酰胺凝膠電泳：蛋白質(zhì)分子大小。2．讀教材P66－69[實(shí)驗(yàn)操作]相關(guān)內(nèi)容，歸納并回答下列問(wèn)題：(1)從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象觀察的角度分析選用哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料的原因？提示：哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核和細(xì)胞器，含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可通過(guò)觀察顏色非常直觀地來(lái)判斷收集流出液的時(shí)期。

(2)運(yùn)用文字和箭頭表示出血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)流程。提示：樣品處理及粗分離―→凝膠色譜操作(純化)―→SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(鑒定)。(3)血紅蛋白的提取和分離中，將分離出的血紅蛋白液進(jìn)行透析的目的什么？提示：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或更換樣品中的緩沖液。(4)根據(jù)哪些指標(biāo)來(lái)判斷凝膠色譜柱裝填成功？提示：無(wú)氣泡；加入大分子有色物質(zhì)后，色帶均勻、狹窄、平整。對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用，首先需要獲得高純度的蛋白質(zhì)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：______________、________________、________________和純度鑒定。(2)如果要從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白，實(shí)驗(yàn)前取新鮮血液要在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉的目的是________________。(3)血紅蛋白的提取又可以細(xì)分為：紅細(xì)胞的洗滌、________________、分離血紅蛋白溶液和________________。其中分離血紅蛋白溶液時(shí)需要用到________________(儀器)分出下層紅色透明液體。(4)裝填凝膠色譜柱時(shí)，要注意色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡必須重新裝。這是因?yàn)開(kāi)_________________________________。(5)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過(guò)透析，這就是樣品的粗分離。①透析的目的是__________________________________。②透析的原理是__________________________________。(6)通過(guò)凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化后，最后經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。①樣品純化的目的是_____________________________。②血紅蛋白的特點(diǎn)是_____________________________。這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義：________________________________________________________________。[解析]

(1)蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定四個(gè)步驟。(2)檸檬酸鈉是一種抗凝劑，能夠防止血液凝固。(3)血紅蛋白的提取可分為：紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液和透析。其中分離血紅蛋白溶液時(shí)需要用到分液漏斗分出下層紅色透明液體。(4)凝膠色譜柱內(nèi)產(chǎn)生的氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。(5)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中進(jìn)行透析，目的是去除分子量較小的雜質(zhì)；因?yàn)橥肝龃苁剐》肿幼杂蛇M(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)。(6)利用凝膠色譜法進(jìn)行純化，目的是將相對(duì)分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)去除，血紅蛋白是有色蛋白，利用凝膠色譜法分離時(shí)，可直接通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷收集洗脫液的時(shí)期。[答案]

(1)樣品處理粗分離純化(2)防止血液凝固(3)血紅蛋白的釋放透析分液漏斗(4