熒光光度法測(cè)定血清中堿性磷酸酶

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２0０９年05月20日１3:４7：33Ｗeｄnesｄaｙ

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作者單位:黃山學(xué)院化學(xué)系，黃山24５０41濰坊醫(yī)學(xué)院,濰坊261041?

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【摘要】

合成了一種新的底物水楊酸磷酸酯(SＰ),用于熒光光度法測(cè)定血清中堿性磷酸酶（ALＰ)活力。在3７.0℃的TｒiｓHCl緩沖液（ｐH9.0）條件下，堿性磷酸酶作用于熒光底物SＰ，水解生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物水楊酸（SA）,生成的ＳA的量與參與反應(yīng)的ALＰ的活力成正比。據(jù)此建立了熒光光度法測(cè)定血清中堿性磷酸酶活力的新方法.測(cè)定堿性磷酸酶的線性范圍是０.03～6．00U/L,檢測(cè)限為７。04mU/L。本方法適用于血清中堿性磷酸酶的測(cè)定.測(cè)定結(jié)果與臨床上常用的以對(duì)硝基苯磷酸酯為底物的分光光度法相比，無(wú)顯著性差異。【關(guān)鍵詞】

堿性磷酸酶熒光光度法水楊酸磷酸酯1

引言

?堿性磷酸酶（ALP，EＣ3.１.３。1)的活性測(cè)定是臨床上最常見(jiàn)的測(cè)定項(xiàng)目之一［１]。血液中的ALP主要來(lái)自于肝臟和骨骼,因此在這些器官發(fā)生病變時(shí)血清ALP活力會(huì)明顯增高。ALＰ活力測(cè)定可作為診斷某些疾病的輔助指標(biāo)［２]。因此，在臨床診斷中簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地測(cè)定血清中ALP的活性是非常重要的.測(cè)定ALP活性的方法主要有分光光度法[１，3,4]，電化學(xué)方法［5，6］、化學(xué)發(fā)光法[7，8]和熒光法［9～1４］等.臨床推薦使用的檢測(cè)ALP方法是利用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物的分光光度法和磷酸苯二鈉作為底物的氨基安替比林比色法［1，3，4］。通常，熒光法的靈敏度較分光光度法高約兩個(gè)數(shù)量級(jí)，且和分光光度法一樣具有所用儀器簡(jiǎn)單、操作方便及易于實(shí)現(xiàn)操作自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇水楊酸磷酸酯(ＳＰ）作為熒光底物,SＰ在4℃的低溫條件下,至少可穩(wěn)定一個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)條件下,合成的新底物ＳP穩(wěn)定性好，熒光背景很低.而SP被ALP水解后生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物水楊酸（SA）,反應(yīng)機(jī)理如下。

熒光分子SA中含有共軛π鍵且SA分子取代基之間形成氫鍵,從而加強(qiáng)了分子的剛性結(jié)構(gòu)，使其熒光強(qiáng)度增強(qiáng),且生成的SA的量與參與反應(yīng)的ALP活力呈線性關(guān)系。據(jù)此建立了熒光法測(cè)定ALP活性的新方法。2

實(shí)驗(yàn)部分２。1

儀器?

?RF540型熒光分光光度計(jì)和UＶ2６5型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）;PＨS３Ｂ型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；離心機(jī)（上海手術(shù)機(jī)械廠).２.2

試劑

水楊酸磷酸酯(SＰ)參照文獻(xiàn)[15］合成并純化，將10。0ｇＳA與1５．0ｇPＣl5混合使之在室溫下反應(yīng)，直到反應(yīng)平緩下來(lái)，然后用60~65℃水浴攪拌加熱1．5h.用冰水浴將反應(yīng)混合物冷卻,然后依次加入25ｍL苯、２５mＬ丙酮和3。5mＬ水.將混合物冰水冷卻30miｎ后，加入50mL苯，再放置２４h。經(jīng)真空干燥過(guò)夜后，用丙酮和苯的混合物重結(jié)晶，可得7.９9gSＰ（產(chǎn)率約51％）。測(cè)得其熔點(diǎn)為163～1６5℃，與文獻(xiàn)[15］報(bào)道的１62。5~16３℃基本符合.底物C、H含量用元素分析儀(美國(guó)PE2４00）測(cè)定(%，括號(hào)為理論值）:測(cè)得值為：C3８.50（38。54），H３.26(3.２４）。?

工作液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1090gＳP，溶于少量0。10moｌ／ＬTｒisHCl緩沖溶液（pＨ9．0）中，并以此緩沖溶液定容至5０0ｍＬ容量瓶，得1。00mmol/L工作液（可穩(wěn)定一個(gè)月以上）。堿性磷酸酶（ＡLP，分析純，Sｉgma公司，１7Ｕ/mｇ）儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0．044１ｇAＬP，溶于少量０.１０mol/LTrisHCl緩沖溶液(pH=9.0）中，并以此緩沖溶液定容至2５0ｍL容量瓶，得3．00U/mL儲(chǔ)備液.使用時(shí)以0．10ｍol/ＬTrｉｓHCl緩沖溶液(pＨ9。0）逐級(jí)稀釋得工作液。水楊酸(ＳA,分析純,北京化學(xué)試劑公司）工作液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取0．0691ｇＳＡ，溶于少量０.10ｍol/ＬＴrisHCｌ緩沖溶液（pＨ9.0）中,并以此緩沖溶液定容至５０0mL容量瓶，得1。00mｍｏl/L工作液。儲(chǔ)備液與工作液均需置于0～4℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)保存。

0．10moｌ／ＬTrisＨCl緩沖溶液(pH９．0)。其余所用試劑均為分析純,所有實(shí)驗(yàn)用水均為石英亞沸蒸餾水。２.3

實(shí)驗(yàn)方法?

?于10mＬ比色管中依次加入１.0mL1.００mmｏｌ／ＬＳP、2。０mＬＴrisＨCl緩沖溶液(ｐH9．０）和0.10ｍＬ0。3０U/ＬＡLP，以石英亞沸蒸餾水定容至刻度，振蕩搖勻，37。0℃水浴放置１0ｍin,用1ｃm熒光池(附有自動(dòng)恒溫裝置)，記錄其熒光光譜。同時(shí)在λex/λem=303／412nm測(cè)定熒光強(qiáng)度Ｆ，同時(shí)測(cè)定試劑空白的熒光強(qiáng)度Ｆ0.經(jīng)過(guò)酶反應(yīng)后,增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度以ΔF（ΔF=F—F0）表示。

3

結(jié)果與討論3。１

ＳＡ和SＰ的熒光光譜?

SA溶液、SP溶液和SPALP混合后體系的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜見(jiàn)圖１。酶反應(yīng)后所得產(chǎn)物SA分子具有強(qiáng)的共軛π鍵，剛性結(jié)構(gòu)以及給電子基團(tuán)（OH)，因此SＡ熒光較強(qiáng)。合成的SP將SA分子中的給電子基團(tuán)(OH）轉(zhuǎn)化為磷酸酯基，使得SＰ的熒光顯著減弱。由圖1可見(jiàn),單純的ＳP溶液熒光很弱（曲線2);在SP中加入ＡＬP后（曲線3），熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)且峰形與SＡ(曲線１）類(lèi)似。熒光光譜說(shuō)明ALP能催化SP水解,生成SA。圖1

熒光激發(fā)光譜（ａ)和熒光發(fā)射光譜（b)

（略)Ｆｉｇ。1

Ｆlｕｏrescenceeｘcitaｔiｏnｓｐeｃtrｕm(ａ）anｄemisｓｉｏｎspectrum(b)１。sａlicyｌicacｉd(ＳＡ）；2.Salｉcylpｈosｐｈａt(yī)ｅ（SP）;

3。SPaｌkaliｎephｏsｐhatase(ALP)．

Eｘｐerimentalconｄｉｔions:1。00×１０－4mol／ＬSA,1。00×10-4mol／LSＰ,0。30U／ＬＡLP,pH9。0，λex=3０3nm。3．２

反應(yīng)條件的優(yōu)化３。2.1

酸度的影響

體系酸度對(duì)酶催化反應(yīng)影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),在pH＝7。5～１0.５之間，體系的ΔＦ先增大后減小，當(dāng)pH在8．0～10.０范圍時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度ΔＦ變化不大。而在pH8.８～9．８范圍內(nèi)，體系的ΔF達(dá)到最大且保持穩(wěn)定,故本實(shí)驗(yàn)選擇pH9。０的0.１0mol／LTrisHCl緩沖體系進(jìn)行進(jìn)一步的研究。結(jié)果表明，加入2.０ｍL緩沖溶液時(shí),ΔＦ達(dá)到最大且保持穩(wěn)定。３。2。2

底物濃度的影響

SP的濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度（ΔＦ）的影響見(jiàn)圖3.由圖3可知,在5.0~50μmｏｌ/L范圍內(nèi),隨著底物SP濃度的增大，體系的熒光強(qiáng)度（即反應(yīng)速度）逐漸增大,當(dāng)SＰ濃度大于5０μmol/Ｌ時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度不隨底物濃度的增大而變化。米氏動(dòng)力學(xué)方程式［16］V＝Vmax·［S]Ｋm＋[Ｓ]反映了酶反應(yīng)速率與底物濃度之間的關(guān)系。

圖2

ｐＨ值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響（略)Fig.2

ＥffectofpHｏｎfluｏｒeｓcenｃｅｉntenｓity?

?圖３

底物SP的濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度(ΔＦ）的影響(略）Fｉg.３

Effectofcoｎcentrａt(yī)iｏnｏfｓubｓtｒａｔeＳPoneｎhancedｆｌuoｒescenceInｔｅｎsiｔy通過(guò)ＬinewｅaｖｅｒBurk雙倒數(shù)轉(zhuǎn)換，得式(1)：1V=ＫmVmaｘ×１［Ｓ]+1Ｖmaｘ（１）式中，V為初速度（mｏl／(ｍin／L)),Vmａx為最大反應(yīng)速度，［S］為底物濃度（mol／Ｌ），Km為米氏常數(shù)（mｏl/L)。本研究以ΔF的值相應(yīng)地代表了酶的反應(yīng)速率。因此得式(2):１ΔF＝ＫmＶmax×1［ＳＰ］+1Vmax（２）所以,以1ΔＦ對(duì)1[ＳP］作圖，得Kｍ值為1.2８×1０—５ｍｏｌ/Ｌ。為了正確測(cè)得酶活力，所選底物濃度應(yīng)遠(yuǎn)大于Kｍ值。因此,本研究選擇濃度為1。００×10-4mol/L.3.２。3

溫度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

同其它酶促反應(yīng)相似，AＬＰ催化SP水解反應(yīng)受溫度影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，Ｆ0隨溫度變化很小；當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，F(xiàn)0隨溫度上升而迅速增加,這是由于底物自身水解的影響所造成；反應(yīng)溫度為30～５0℃時(shí),ΔF達(dá)到最大值且保持不變,本實(shí)驗(yàn)選擇３7．0℃進(jìn)行下一步研究,這樣既保證了酶活性,又與臨床應(yīng)用的生理環(huán)境相一致。

圖4

反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度（ΔF）的影響（略）Fig。4

Efｆectoｆiｎcｕｂatｉoｎtiｍeｏnenhancedfｌuoresｃenceｉntenｓitｙ3。2。4

反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

同其它酶促反應(yīng)相似，ALP催化SP水解反應(yīng)受反應(yīng)時(shí)間影響較大。由圖4可見(jiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，Ｆ０基本保持穩(wěn)定，而F和ΔＦ隨之增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在１８０ｍｉn內(nèi)，體系熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)（ΔF)與反應(yīng)時(shí)間成正比。為了提高分析速度,選擇孵育時(shí)間為10min，此時(shí)已有較強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)和足夠的靈敏度。3.3

分析應(yīng)用3.3.１

線性范圍與檢測(cè)限

在選定的最佳條件下，體系增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度與ＡＬP的活性在0.03~６.０0U／L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔＦ=7６。7３C+11．３２，相關(guān)系數(shù)0.9９6?？瞻兹芤旱臉?biāo)準(zhǔn)偏差為0。18時(shí)（n＝１1），檢出限為７。04mU/L。表１

人血清中ALＰ活性的測(cè)定(略）Tabｌe1

DeterminatｉｏnofactiｖiｔｙofALＰiｎsｅrｕｍsａmplｅs3。3.2

人血清AＬP活性的測(cè)定

取人血清0.1０mL，按上述實(shí)驗(yàn)方法直接測(cè)定其中所含ALＰ的活性；同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)比色法（以對(duì)硝基苯磷酸酯為底物）[4]測(cè)定該樣品，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,與臨床上常用的以對(duì)硝基苯磷酸酯為底物的比色法相比，本實(shí)驗(yàn)方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。一、pH對(duì)酶的影響?酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，具有兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，在一定溶液中可以發(fā)生解離作用。酶在水溶液環(huán)境中的解離狀態(tài)和行為,都受到H＋的影響.酶活性中心功能基團(tuán)的解離狀態(tài)隨著溶液的pH值改變而改變，因此,溶液的H+濃度對(duì)酶催化反應(yīng)的速度有明顯的影響,而且其影響機(jī)理非常復(fù)雜.這是因?yàn)樵诿阜肿拥幕钚圆课簧暇哂泻芏嗟乃嵝曰驂A性氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán),它們可隨著ｐH的變化而發(fā)生解離，并屬于不同的正負(fù)高價(jià)離子或等電荷狀態(tài)，它們將直接影響到酶的活化以及酶與底物的親和力。有些酶需要高濃度的氫離子才能活化，例如胃蛋白酶原只有在pH1。8左右時(shí)才可以活化為胃蛋白酶。絕大多數(shù)酶類(lèi)都可以因酶分子表面極性基團(tuán)的解離而改變酶活性部位的原有構(gòu)象，或改變輔酶、輔基或活化因子的結(jié)合，從而導(dǎo)致酶催化反應(yīng)速度的變化,另一方面,pH亦影響到酶促反應(yīng)的進(jìn)行。總之，pH是決定酶催化活性的重要參數(shù)之一，ｐH變化能使酶活力提高或下降。在生理生化反應(yīng)中，我們可以通過(guò)調(diào)控ｐH值，提高某種酶的活力,而降低其他酶的干擾作用。在工業(yè)生產(chǎn)上，特別是利用大型生物反應(yīng)器時(shí)，調(diào)控反應(yīng)系統(tǒng)的pH以控制酶活力往往是生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵.因此，研究pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響是探討酶催化作用機(jī)理的重要手段之一。

不同的酶，氨基的組成不同,則酶分子中可解離的基團(tuán)性質(zhì)不同，這些基團(tuán)隨著ｐH的變化可以處于不同的解離狀態(tài)，側(cè)鏈基團(tuán)的不同解離狀態(tài)即可以影響底物的結(jié)合和進(jìn)一步的酶催化反應(yīng)、也能影響酶的空間構(gòu)象，從而影響到酶的催化活性.pH對(duì)酶活性的影響主要有以下幾個(gè)方面:?１．過(guò)酸或者過(guò)堿都可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞,而引起酶的變性,導(dǎo)致酶活力的下降.這種酸堿的失活作用一般有兩種情況,可逆的失活和不可逆的失活。當(dāng)適當(dāng)?shù)馗淖內(nèi)芤旱膒H值，酶活力可以恢復(fù)的為可逆的失活(reｖｅrsiｂleinａctｉｖaｔiｏｎ）,否則，為不可逆的失活（irr