辣根過氧化物酶

辣根過氧化物酶臨床檢驗試劑中的常用酶01簡介制備目錄02基本信息辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP），是臨床檢驗試劑中的常用酶。該產(chǎn)品不但廣泛用于多個生化檢測項目，也廣泛運用于免疫類（ELISA）試劑盒。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關鍵成分，對試劑盒的質量有重要影響。簡介用途該酶催化簡介該酶催化Donor+H2O2--→Oxidizeddonor+2H2O。辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）

比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同工酶組成，分子量為40,000，等電點為pH3～9，酶催化的最適pH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ（德文ReinheitZahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右（最高可達3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途（1）RZ＞3活性＞250u/mg，主要應用于免疫學，是高純度的過氧化酶。采用特殊色譜純化技術以除去會影響免疫學反應的同工酶B.（2）RZ＞2活性＞180u/mg，主要應用于臨床化學，我們的客戶也有將這個規(guī)格的產(chǎn)品應用于免疫學研究的。此時，一個標準化的分析方法就變得尤為重要。（3）RZ＞1活性＞100u/mg，主要應用于血糖試紙和尿液分析試紙。（4）RZ＞0.6活性＞60u/mg，主要應用于尿液分析試紙。制備實驗原理操作步驟儀器和試劑制備實驗原理過氧化物酶催化以下反應：2H2O2→O2+2H2O這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質類（hemeProteins）。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。本實驗是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冷凍干燥，最后制得高純度的辣根過氧化物酶。辣根過氧化物酶分子量在40,000左右，是一種含亞鐵血紅素的蛋白質，等電點7.2；易溶于水，溶解度為5%（W/V），溶液呈棕紅色，透明；也溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶最適pH為7.0（對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言）。在室溫下HRP在幾周內保持穩(wěn)定，加熱到63℃后15分鐘內穩(wěn)定。辣根過氧化物酶氧化還原電勢很低，pH6.08時，E’0=-0.2070V；pH為7.71時，E’0=-0.5787V。儀器和試劑儀器離心機、干燥器、分光光度計。試劑⒈硫酸銨：工業(yè)純和化學純；⒉丙酮。⒊10mMpH7.0磷酸鹽緩沖液：稱取243.5毫克磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），溶于400毫升水中。⒋20mM愈創(chuàng)木酚溶液：取0.22毫升愈創(chuàng)木酚加水至100毫升。⒌40mM過氧化氫溶液：取0.4毫升30%過氧化氫加水至100毫升（如測k1則用10mM過氧化氫溶液）。臨用前配制。⒍5%乙酸鋇溶液⒎奈氏試劑操作步驟（一）HRP的制備⒈水提?。悍Q取10斤用水沖刷干凈的鮮辣根（辣根皮中亦含有豐富的HRP），用菜刀切成小碎塊，在攪肉機中攪碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水在低溫下攪拌提取過夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干機（或離心機）甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取一次，合并兩次濾液，量總體積和度，0。⒉硫酸銨分級分離：在不斷攪拌下，每升濾液中慢慢加入226克硫酸銨粉末（相當于0.40飽和度），大約在1~2小時內加完，置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面渾濁液以3000轉/分離心15分鐘，棄沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸銨粉末（0.8飽和度）隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解后，置冷室過夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機中以轉/分離心20分鐘，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150毫升蒸餾水中（加水量要使沉淀全部溶解為止），分裝于透析袋內，放在流動自來水中進行透析1~2天，直到硫酸銨透析完畢為止（可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查）。然