形態(tài)定量技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)(研究生課程)

形態(tài)定量技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)研究生學(xué)位課程《現(xiàn)代組織化學(xué)原理與應(yīng)用》主講人 李慧主要內(nèi)容概況圖像分析系統(tǒng)的組成圖像處理和分析的基本方法圖像分析系統(tǒng)的定量測(cè)定方法圖像細(xì)胞光度技術(shù)激光共聚焦顯微鏡激光捕獲顯微切割儀形態(tài)定量技術(shù)的應(yīng)用前景概況形態(tài)定量體視學(xué)、圖像分析技術(shù)形態(tài)定量技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)概況體視學(xué)(stereology) 1961年命名體視學(xué)是關(guān)于能在結(jié)構(gòu)的切面上測(cè)得的2維信息推斷其3維參數(shù)的數(shù)字方法(E.R.Weibel)從圖像中提取有用的測(cè)量數(shù)據(jù)或信息，非圖像的數(shù)值或符號(hào)的描述或表達(dá)圖像特征的提??；圖像中幾何形態(tài)參數(shù)的測(cè)量；從二維形態(tài)參數(shù)推導(dǎo)出三維形態(tài)參數(shù)概況60年代 顯微分光光度技術(shù)-組織化學(xué)90年代- 圖像分析系統(tǒng)(imageanalysissystem) 圖像細(xì)胞儀(imagecytometer) 流式細(xì)胞儀(FlowCytometry) 激光共聚焦顯微鏡(Confocal)概況中國(guó)體視學(xué)會(huì)生物醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)(1988年成立)中國(guó)體視學(xué)及圖像分析學(xué)術(shù)年會(huì)中國(guó)生物醫(yī)學(xué)體視學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)國(guó)際體視學(xué)大會(huì)(1963年第一屆)國(guó)際診斷定量病理學(xué)會(huì)概況現(xiàn)代組織化學(xué)定量技術(shù)組化/免疫組化結(jié)果分析 定性/半定量分析(有局限性)定量分析圖像分析技術(shù) 組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的定量分析(光密度測(cè)定) 細(xì)胞/某一特定成分形態(tài)的定量分析圖像分析系統(tǒng)的組成圖像分析儀涉及計(jì)算機(jī)、光學(xué)、電子學(xué)、形態(tài)學(xué)、數(shù)學(xué)、電視技術(shù)等多學(xué)科概況圖像的處理和分析醫(yī)學(xué)圖像處理 大、中、小型真彩色、偽彩色型全自動(dòng)、半自動(dòng)型多功能和精密度醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)圖像處理和分析的基本方法 對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)字處理提高信噪比和清晰度改善和突出圖像質(zhì)量提取有用或隱含信息客觀的和定量的特性判別、特征描述和數(shù)值測(cè)量(不依人眼觀察效果為標(biāo)準(zhǔn))

圖像處理和分析的基本方法圖象處理方法

圖像的預(yù)處理、圖像變換、圖像平滑、圖像增強(qiáng)、圖像分割偽彩色圖像和圖像識(shí)別等

圖像處理和分析的基本方法濃度信息--灰度(greylevel)代表圖像各部分顏色的深淺灰度等級(jí)反映圖像分析儀的分辨率目前圖像分析儀多用256級(jí)灰度 (人眼分辨率：20級(jí)灰度以下)圖像處理和分析的基本方法圖像預(yù)處理 尤其是對(duì)模糊、失真或有噪聲的圖像進(jìn) 行預(yù)處理，使之能恢復(fù)原來(lái)狀況圖像增強(qiáng) 修正灰度；過(guò)濾噪聲等改善圖像質(zhì)量圖像編輯 對(duì)圖像進(jìn)行增補(bǔ)、修改等，去除 不必要 信息，增添某些重要信息，如畫(huà)線功 能；剪輯框等圖像分割 將所要研究對(duì)象或區(qū)域分離出來(lái)(自背景) 樣品(切片)和染色質(zhì)量影響很大 閾值分割；邊緣分割；數(shù)字形態(tài)運(yùn)算等圖像分析系統(tǒng)的定量測(cè)定及方法

應(yīng)用范圍十分廣泛生物醫(yī)學(xué)圖象 X-ray圖像超聲醫(yī)學(xué)圖像核醫(yī)學(xué)圖像醫(yī)學(xué)斷層圖像顯微醫(yī)學(xué)或細(xì)胞圖像圖像分析系統(tǒng)的定量測(cè)定及方法

二維幾何參數(shù)測(cè)量和灰度參數(shù)測(cè)量二維幾何參數(shù)測(cè)量 對(duì)細(xì)胞及其結(jié)構(gòu)的形狀、大小、輪廓規(guī)則程度等定量測(cè)定200種以上的形態(tài)特征參數(shù) 較常用者： 細(xì)胞(核)面積、周長(zhǎng)、直徑、長(zhǎng)徑和短徑；平均直徑(不規(guī)則細(xì)胞的等效面積的圓直徑)；形狀因子(形狀不規(guī)則的程度)圖像分析系統(tǒng)的定量測(cè)定及方法

灰度參數(shù)測(cè)量

反映圖像的濃度信息灰度測(cè)量(Gray)和光密度測(cè)量(OD)不完全等同圖像細(xì)胞光度技術(shù)

圖像細(xì)胞光度技術(shù)(ImageCytometry，ICM)

指采用某些技術(shù)使玻片上的組織細(xì)胞成像，測(cè)量組織細(xì)胞圖像的光度信息，并以吸收光度或熒光光度值的大小表述細(xì)胞化學(xué)物質(zhì)含量的多少，以評(píng)定組織細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的含量，又稱(chēng)作細(xì)胞圖像光度測(cè)量術(shù)或成像細(xì)胞測(cè)量術(shù)圖像分析系統(tǒng)的定量測(cè)定及方法

應(yīng)用過(guò)程器官、組織和細(xì)胞樣本的采集與制備組織細(xì)胞的成像、分析和測(cè)量數(shù)據(jù)結(jié)果的分析和應(yīng)用圖像細(xì)胞光度技術(shù)

測(cè)定細(xì)胞或其結(jié)構(gòu)經(jīng)染色后的光密度光密度定量遠(yuǎn)較形態(tài)結(jié)構(gòu)定量為復(fù)雜，精度要求很高圖像細(xì)胞光度技術(shù)

定量顯微術(shù) 形態(tài)測(cè)量(Morphometry)顯微分光光度術(shù)(Microspectrophotometry)流式細(xì)胞儀(FlowCytometry,FCM)細(xì)胞光度術(shù)(Cytometry)主要用于定量DNA分析、定量免疫組織化學(xué)測(cè)定圖像細(xì)胞光度技術(shù)

DNA

ContentAnalysis

細(xì)胞核中DNA含量的定量分析Diploid/Aneuploid(腫瘤鑒別診斷)微觀，較早期的診斷DNA染色-Feulgen染色正常細(xì)胞diploid測(cè)量值DNAIndex(正常DI=1，惡性腫瘤DI1)G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞周期分析圖像細(xì)胞光度技術(shù)

免疫組化結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、陽(yáng)性面積百分比、陽(yáng)性細(xì)胞陰性細(xì)胞比值陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度值ISH結(jié)果定量 非同位素法(酶或熒光標(biāo)記物)

圖像細(xì)胞光度技術(shù)

顯微測(cè)量光密度技術(shù)圖像分析系統(tǒng)性能的生物學(xué)評(píng)估光學(xué)組件缺陷評(píng)估

同一細(xì)胞在圖像顯示窗不同位置分別測(cè)量得出的積分吸光度誤差CV應(yīng)小于3%，以評(píng)價(jià)系統(tǒng)是否有效地消除了閃光誤差和照射光強(qiáng)度分布不均對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響圖像細(xì)胞光度技術(shù)

顯微測(cè)量光密度技術(shù)圖像分析系統(tǒng)性能的生物學(xué)評(píng)估系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)估

同一顯微圖像分析系統(tǒng)中，不同操作者在不同時(shí)間對(duì)同一圖像顯示窗位置的同一細(xì)胞圖像測(cè)量得出的積分吸光度誤差CV應(yīng)小于1%圖像細(xì)胞光度技術(shù)

顯微測(cè)量光密度技術(shù)圖像分析系統(tǒng)性能的生物學(xué)評(píng)估涂片細(xì)胞樣品評(píng)估

Feulgen染色，雞紅細(xì)胞核涂片其面積的CV應(yīng)小于10%，單個(gè)雞紅細(xì)胞核的積分吸光度值CV應(yīng)小于6%，2個(gè)、3個(gè)和4個(gè)雞紅細(xì)胞核的積分吸光度值與單個(gè)雞紅細(xì)胞核積分吸光度值相比是否呈2、3、4的線性增加，以評(píng)定涂片細(xì)胞化學(xué)物質(zhì)計(jì)量結(jié)果的可靠性DNA圖像分析儀與流式細(xì)胞儀的比較激光共聚焦顯微鏡

激光共聚焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscopy,LSCM)

一種特殊形式的光鏡，主要是通過(guò)激光束掃描樣本形成圖像，然后以數(shù)字信號(hào)的形式存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中并可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組織和細(xì)胞組織切片，細(xì)胞活體的生長(zhǎng)發(fā)育特征測(cè)定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和能量轉(zhuǎn)換；活體細(xì)胞中離子和PH值變化神經(jīng)遞質(zhì)研究多重?zé)晒獾臄鄬訏呙杓爸丿B；熒光光譜分析熒光組織與細(xì)胞的三維動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)件熒光共振能量的轉(zhuǎn)移的分析；熒光原位雜交研究（FISH）細(xì)胞骨架研究基因定位研究；蛋白質(zhì)間研究原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析熒光漂白恢復(fù)研究（FRAP）胞間通訊研究膜電位與膜流動(dòng)性等研究圖像分析和三維重建等分析FRAPFRAP激光共聚焦顯微鏡

“視覺(jué)斷層”

可以掃描標(biāo)本的極窄的片層并成像，即具有較窄的視野深度(深度識(shí)別能力：200-400m)只有在焦距平面的信息可以被檢測(cè)，在樣本內(nèi)獲得一個(gè)單一的圖像“光學(xué)切片”和“顯微CT”

通過(guò)調(diào)節(jié)不同的焦距(微型步進(jìn)馬達(dá)，0.1m)逐層獲得高反差、高分辨率、高靈敏度的一系列二維光學(xué)橫斷面圖像)，最終可以在三維空間中觀察結(jié)果和對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定LSCMhistory1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，獲得了美國(guó)的專(zhuān)利。?1967年，Egger和Petran成功地應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫斷面。?1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關(guān)系和激光掃描器的拉曼光譜學(xué)。?1984年，Biorad為公司推出了世界第一臺(tái)商品化的共聚焦顯微鏡，型號(hào)為SOM-100，掃描方式為臺(tái)階式掃描。?1986年MRC-500型改進(jìn)為光束掃描，用作生物熒光顯微鏡的共聚焦系統(tǒng)。?1987年White和Amos在英國(guó)《自然》雜志發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時(shí)代的到來(lái)”一文，標(biāo)志著LSCM已成為進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具。?隨后Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相繼開(kāi)發(fā)出不同型號(hào)的共聚焦顯微鏡，產(chǎn)品的性能不斷改進(jìn)和更新，應(yīng)用的范圍也越來(lái)越廣泛。LSCM成像原理采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱(chēng)為照明針孔和探測(cè)針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過(guò)一系列的透鏡，最終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來(lái)自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來(lái)自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。Confocal的基本工作原理Cellculture,3Dshadowprojection(calculatedby"Imaris",BitplaneAG,Zürich)showingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)多熒光電子顯微鏡

透射電子顯微鏡

以電子束透過(guò)樣品經(jīng)過(guò)聚焦與放大后所產(chǎn)生的物像，投射到熒光屏上或照相底片上進(jìn)行觀察。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數(shù)為幾萬(wàn)～幾十萬(wàn)倍。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。掃描電子顯微鏡

掃描電鏡是用極細(xì)的電子束在樣品表面掃描，將產(chǎn)生的二次電子用特制的探測(cè)器收集，形成電信號(hào)運(yùn)送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。（細(xì)胞、組織）表面的立體構(gòu)像，可攝制成照片。DefinitionofLMD顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細(xì)胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細(xì)胞從組織三維構(gòu)造中分離出來(lái)，獲得純的細(xì)胞群（purecellpopulation），以備進(jìn)一步作分子水平的研究。顯微切割技術(shù)的貢獻(xiàn)就是克服了組織的細(xì)胞成分非常繁雜這一重大的缺點(diǎn)。Lasercapturemicrodissection

TheHistoryofLMD1965，BaxterTJ，腎小管1990‘s，紫外激光切割超薄膜上的組織1996，NIH，紅外激光光源，轉(zhuǎn)運(yùn)膜技術(shù)美國(guó)Arcturus公司：熱塑膜德國(guó)PALM公司：激光脈沖所產(chǎn)生的壓力AdvanceofLMD⑴無(wú)破壞性，用于粘附目的細(xì)胞的熱塑膜厚度約為100～200μm,能夠吸收激光產(chǎn)生的絕大部分能量，⑵高精確性，激光定位的準(zhǔn)確程度可以達(dá)到1μm，切割直徑可以小到2μm，捕獲點(diǎn)范圍達(dá)到3～5μm，⑶高效率，每次激發(fā)耗時(shí)不超過(guò)1秒,,單張轉(zhuǎn)運(yùn)膜可以一次捕獲上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；⑷自動(dòng)化程度高，全電腦操作⑸無(wú)污染，使用全封閉操作，能避免外來(lái)物質(zhì)的污染。WeaknessofLMD用儀器和耗材昂貴；QIAGEN染色時(shí)對(duì)后續(xù)反應(yīng)可能有影響；對(duì)涂片的要求比較苛刻等。UseOfLMDCancer腫瘤基因突變檢測(cè)腫瘤特異基因表達(dá)分析雜和性丟失檢測(cè)微衛(wèi)星序列不穩(wěn)定性分析新基因發(fā)現(xiàn)核酸及蛋白質(zhì)的定量研究染色體畸變分析細(xì)胞局部病變病因?qū)WPathologyandForensic

組織切片冰凍切片檢驗(yàn)。法醫(yī)學(xué)中的各種細(xì)胞涂片,目前常見(jiàn)的法醫(yī)物證檢材如液體類(lèi)(精液、血液、唾液、精陰混和液)、斑跡類(lèi)(精斑,血斑,唾液斑,混和斑等)等NotetheuseofLCM

DNA分析基因組DNA時(shí),細(xì)胞越大,則需要切割更多的細(xì)胞,才能保證包含細(xì)胞的全部基因組保持基因組的相對(duì)完整性,避免在樣品處理過(guò)程中造成DNA的降解和斷裂RNA建議樣本使用冰凍組織塊,同時(shí)用Trizol法抽提原始組織樣本RNA,鑒定樣本降解情況,確保樣本質(zhì)量。常規(guī)HE染色,伊紅和蘇木精配好后用DEPCProtein可以根據(jù)需要制備總蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白通過(guò)去除白蛋白來(lái)減少