時間分辨熒光免疫分析

時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初問世的一種超靈敏度的標記免疫檢測技術。其主要特點是以銅系元素箱(Eu3+)等標記抗體或抗原為示蹤劑，利用增強液的熒光放大作用和時間分辨熒光法排除樣品或試劑中非特異性熒光物質的干擾，最大限度地提高了檢測方法的靈敏度和特異性，還具有量程寬，操作簡便，標記物容易制備，穩(wěn)定性好，保存期長等諸多優(yōu)點。一、基本原理與放免分析相似，總體上分為競爭法和非競爭法兩類，前者多用于小分子半抗原,后者用于大分子化合物。鐮1系元素錯(Eu)、杉(Sm)、鉞(Tb)和鈦(Nd)通過雙功能螯合劑，在水溶液中很容易與抗原或抗體分子以共價雙鍵結合。經抗原、抗體間特異性的免疫結合反應，測定免疫復合物的熒光強度，就可推算待測物質的濃度。錮系離子的熒光信號極弱，需要在酸性條件下，解離出輛系離子，然后與熒光增強液中的二酮體生成新的螯合物，經紫外光激發(fā)可產生強而持久的熒光信號,其增強效力可達100萬倍，故又稱解離增強鍋系熒光免疫分析(dissociation-enhanced-lanthanidefluoroimmunoassay,DELFIA)。輛系元素的發(fā)光時間延長，如Eu"和Sn?+的熒光衰變時間分別達到4.3X105ns和4.IX10ns,而樣品和試劑中的自然本底熒光的衰變時間僅為4—10ns,通過延遲測量時間，使信號不受本底熒光影響。此外，錮系元素螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，stokes位移大，有利于排除非特異性散射光的干擾,進一步提高熒光信號的特異性。二、試劑組成(-)E心標記物：可分為標記抗體、標記抗原，要求有較高的純度、比活性和免疫活性。密封后42或-2(rc保存，但應避免反復凍融。若發(fā)現蛋白質聚合，非特異性結合升高，則應停止使用。(二)固相抗體或抗原：固相載體多用聚苯乙烯微孔條，要求透明度高，吸附性能好，材質均勻，孔間差異小，不同品牌甚至不同批號的微孔條間都會有明顯的性能差異，應引起注意。包被抗原純度要求高；包被抗體要求效價高，親和力強。包被后經牛血清白蛋白封閉，干燥后在4寸、密封、避光、干燥的環(huán)境中保存。（三）增強液：試劑純度不高、器皿清潔度不良或不明原因的污染均可導致增強液熒光本底升高。因此必須注意試劑的純度；批號的差異，器皿要用10g/L的EDTA-Na2溶液浸泡，再用三蒸水洗滌。新配制增強液應用100ml塑料瓶在4C下保存。（四）校準試劑或標準品：指用生物液或緩沖液配制的一組不同濃度的待測物質溶液，用于制作計量一反應曲線或用作陰、陽性對照和cutoff值校準。其濃度已用法定標準物為基準進行標定，標示值與實測值的偏差不得超過±10虬蛋白質類生物活性物質應進行免疫活性測定，證明其同質性。42或-2CTC保存。（五）質量控制樣品：參見放射免疫部分。三、檢測步驟以Wallac公司autoDELFIA全自動時間分辯熒光免疫檢測系統(tǒng)測定hTSH為例，其免疫反應原理為雙抗體夾心法，全部試驗過程均在autoDELFIA全自動時間分辯熒光免疫檢測系統(tǒng)上按預設程序自動完成，整個檢測過程用時約2.5hr左右。步驟如下：.將100樣品或標準品按順序加入抗體包被的微孔條中。.每孔加入100U1稀釋過的E1+標記抗體工作液。.孵育2hro.洗滌6次，除去游離Ei?一標記抗體。.每孔加增強液200口1,反應5min。.測定熒光強度并經數據處理計算待測物質濃度。四、資料保存及報告要求所有原始記錄應妥善保存，以被查考。報告內容包括病人姓名、編號、項目、送檢日期、測定日期、測定結果和正常參考值，推薦使用計算機管理系統(tǒng)對資料進行儲存、分類、查詢、報告、收費和制作統(tǒng)計報表。五、質量控制見放射免疫部分。六、注意事項TRIFA法易受內源性和外源性污染，因為在自然環(huán)境中錮系離子存在十分廣泛，如空氣中的塵埃、煙霧，北方地區(qū)尤甚。故需嚴格控制實驗條件，防止污染。（一）器材的清潔度實驗所用的一切器材，包括微孔條、加樣器、加樣頭、試劑瓶必須專用，并經嚴格洗滌，方法是：2mol/L鹽酸浸泡24h,再經0.1%環(huán)化二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸泡2?4h,蒸儲水沖洗3?5次，再用高純度蒸儲水沖洗2?3次，45?5CTC干燥后密封儲存。（二）蒸僧水的質量蒸儲水的純度直接影響所制的緩沖液、增強液和洗滌液的本底熒光，通常要求采用三蒸水，最后一次蒸儲采用亞沸石英蒸偏器處理。（三）所有實驗用試劑必須作本底熒光測定，首先測增強液本底熒光，應<1500cps,其余試劑各取25R1,加增強液200R1,振蕩15min,放置20min后測熒光強度，以不高于增強液本底熒光30%為