高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選6頁一：前言1.掌握從環(huán)境中采集樣品并從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。2.鞏固以前所學的微生物學實驗技術。3.學會篩選高產(chǎn)淀粉酶菌株。1.α-淀粉酶是一種液化型淀粉酶，它的產(chǎn)生菌芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉類物質的土壤等樣品中。2.從自然界篩選菌種的具體做法，大致可以分成以下四個步驟：采樣、富集培養(yǎng)、初步篩選、分離純化和性能測定。a)采樣：即采集含菌種的樣品采集含菌樣品前應調查研究一下自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然后才可著手做各項具體工作。在土壤中幾乎各種微生物都可以找到，因而土壤可說是微生物的大本營。例如廚房土壤、面粉加工廠和菜園土壤中淀粉的分解菌較多。b)富集培養(yǎng)：富集培養(yǎng)就是在所采集的土壤等含菌樣品中加入某些物質，并創(chuàng)造一些有利于待分離微生物生長的其他條件，使能分解利用這類物質的微生物大量繁殖，從而便于我們從其中分離到這類微生物。c)初步篩選：i.初篩使用選擇培養(yǎng)基對菌種進行培養(yǎng)，通過培養(yǎng)基的特殊成分，來篩選出目的菌種，從而進行培養(yǎng)。ii.初篩利用鑒別培養(yǎng)基，通過添加一些特殊的試劑或成分來鑒別出目的菌種，從而篩選出來并對其進行培養(yǎng)。d)分離純化：通過上述的篩選只能說我們要分離的目的菌種已經(jīng)存在，但還要把夾雜在其中的雜菌除去，從而得到純種的菌落。純種分離的方法很多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細胞分離法、菌絲尖端切割法等。e)性能測定：分離純化得到的菌種之后，所分得的菌種是否具有實驗所要求的性能，還必須要進行性能測定后才能決定取舍。。二、實驗材料：接種環(huán)、試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、移液管、高壓蒸汽滅菌鍋、玻璃棒、量筒、酒精燈、紗布、棉花、面線繩、恒溫培養(yǎng)箱載玻片可見分光光度計顯微鏡紫外操作臺實驗試劑：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、瓊脂粉、蒸餾水、盧卡式碘液、95%乙醇、蕃紅、革蘭氏碘液培養(yǎng)基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸餾水中，一邊加熱再慢慢加入5g瓊脂粉三：實驗步驟1培養(yǎng)基的制備及其儀器的滅菌（1）按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl1.3g、淀粉2g、溶于50mL蒸餾水中，一邊加熱再慢慢加入5g瓊脂粉放入燒杯中。加水到250mL熔解,并做好標記,再加入瓊脂加熱溶化,溶解2h，最后補充水到標記處，裝入三角燒瓶內，加塞包扎。（2）試管中加入9ml水，2個錐形瓶中加入150mL水，將所有待滅菌儀器和培養(yǎng)基用報紙包扎，121℃，30分鐘高壓蒸汽滅菌。（3）倒平板2產(chǎn)淀粉酶菌株的分離、純化（1）采集土壤樣本取離地面5-15cm處的土樣10g（2）稀釋稱取土樣10g，放入盛有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，至于搖床搖1小時，使土樣和水充分混合，使細胞分散。用一只無菌吸管吸取1ml土壤懸浮液加入盛有9ml含有無菌水的試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，依此稀釋10-2、10-3、10-4、10-5、10-6幾種稀釋度的土壤溶液。（3）初步篩選用稀釋樣品的不同吸管分別依次從10-6、10-5、10-4、10-3樣品稀釋液中，吸取0.2mL于冷卻凝固的平板上，用涂布棒涂抹均勻。倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)24小時后，取出平板，注入1-2ml碘液，觀察其透明圈，因淀粉遇碘變藍色，如菌落周圍有透明圈，說明該菌能產(chǎn)生淀粉酶使其水解。從平板上選取淀粉水解圈直徑與菌落直徑之比較大的單菌落，用接種環(huán)沾取少量菌株采用四區(qū)域劃分法。（4）取長勢好的菌株重復篩選3次（5）將篩選所得單菌落進行革蘭氏染色觀察其形態(tài)涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用新配的碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。復染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀察染色結果。（6）酶活力測定接種環(huán)沾取少許菌株于裝有5ml無菌水的試管中，充分振搖，倒入離心試管中，4000r/min離心30min,取3支試管，標明BO,B及U（BO：空白管，B：對照管，U：待測管），分別加入0.4g/ml淀粉緩沖液1ml，U管中加入離心所得的上清液100ul，BO管中加入蒸餾水100ul。混勻后放入37℃水浴箱準時水浴7.5min，取出加入碘應用液1ml搖勻，此時B管中加入上清液100ul。各管再加蒸餾水搖勻，660nm的波長下測吸光度。酶活力計算：U＝（AB-AU）×80ABO（1）移液管吸取0.2ml菌懸液于12個平板上，用涂布棒涂抹均勻，分別紫外光照突變30s、1min、3min、5min(各時間梯度3個平板)，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時。（2）將上述單菌落進行革蘭氏染色觀察其形態(tài)涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用新配的碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。復染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀察染色結果。（3）酶活力測定接種環(huán)沾取少許菌株于裝有5ml無菌水的試管中，充分振搖，倒入離心試管中，4000r/min離心30min,取3支試管，標明BO,B及U（BO：空白管，B：對照管，U：待測管），分別加入0.4g/m