蛋白質結構與功能及研究方法

蛋白質的結構與功能為什么研究蛋白質的結構與功能對蛋白質結構和作用機理的深層次理解對蛋白質結構進行改造的基礎對蛋白質功能的控制“隨心所欲”創(chuàng)造具有新功能的蛋白質血紅蛋白的結構、功能及鐮刀形貧血病血紅蛋白（Hemoglobin,Hb)Hb(Mr64500)幾乎呈球形(d=5.5nm)，四聚體，每個亞基含一個血紅素(heme)輔基，2個亞基(141AAs)和2個亞基(146AAs)。亞基的三維結構相似(與肌球蛋白的一致)。血紅蛋白的四級結構顯示了不同亞基間強的相互作用。11界面(22)間存在強相互作用，即使用尿素處理，得到的是完整的二聚體，界面間是明顯的疏水作用，但也存在許多氫鍵和一些離子對作用。結合氧后引起結構改變

血紅蛋白有兩個主要的構象：R態(tài)(relaxed)和T態(tài)(tense)，氧可以與兩種狀態(tài)結合，但對R態(tài)的親和力更大。無氧結合時，T態(tài)更穩(wěn)定，表現(xiàn)出去氧血紅蛋白的主要的構象。T態(tài)因更多的離子對作用更為穩(wěn)定，其中的多數(shù)存在于12（及21)界面間。氧與Hb一個亞基的T態(tài)結合，引起構象改變?yōu)镽態(tài)，當整個蛋白質發(fā)生這樣的構象改變，單個亞基的結構幾乎沒有改變。但亞基對相互滑動和旋轉，使得亞基間的口袋變窄。這一過程中，穩(wěn)定T構象的一些離子對被打破，同時產(chǎn)生一些新的離子對。去氧血紅蛋白的T狀態(tài)??TR轉變。帶正電荷的側鏈（藍色）和帶負電荷的側鏈（粉紅色）形成離子對。每個亞基的LysC5和每個亞基的AspFG1能夠看到，未作標記。結合氧的血紅素附近的構象變化。MaxPerutz假定TR的轉變是由于血紅素周圍幾個關鍵氨基酸側鏈位置的改變所引起的。T態(tài)的血紅素輕微皺褶，引起血紅素鐵突出His的側鏈。氧的結合引起血紅素呈現(xiàn)更平坦的構象，將His側鏈改變而接觸F螺旋。S形（協(xié)同）結合曲線?？梢钥闯煞从车陀H和與高親和狀態(tài)轉變的雜合曲線。表明血紅蛋白在組織和肺之間對氧濃度微小差異更為敏感，使得血紅蛋白在高氧分壓的肺中能夠結構氧，在低分壓的組織釋放出氧。pH對氧與血紅蛋白結合的影響。肺中血液的pH為7.6，組織的血液pH為7.2，實驗測定血紅蛋白與氧的結合在pH7.4。氧與血紅蛋白的結合受

2,3-二磷酸甘油酸（BPG）的調控2,3-二磷酸甘油酸(BPG)與Hb的作用表現(xiàn)為一種向異性的變構調控行為。紅細胞中BPG的濃度相對較高。BPG能大大降低Hb對氧的親和力。

HbBPG+O2HbO2+BPGBPG結合Hb的位點與氧的不同，可以調控肺中與氧分壓相關的氧與Hb的親和力。高緯度時，BPG對于較低氧分壓的生理適應起著重要作用。健康人體在海面上能釋放40%的氧進入組織，如果被迅速轉移到4500米的山上(pO2低)，其向組織釋放氧的能力降低。幾個小時后血液BPG的濃度上升，降低Hb與氧的親和力，這種調節(jié)對于肺中氧的結合影響不大，但對組織中氧的釋放影響很大，可以恢復釋放血液攜帶氧的40%進入組織。正常人位于海平面時血液中的BPG約為5mM，高緯度時約為8mM。BPG與去氧血紅蛋白的結合。BPG的結合穩(wěn)定去氧Hb的T態(tài)(a)，BPG所帶負電荷與T態(tài)亞基口袋周圍的正電荷側鏈作用(b)，由于氧的結合，T態(tài)轉變?yōu)镽態(tài)，BPG結合的口袋消失(c)。血紅蛋白分子病MolecularDiseaseofHemoglobin有時候蛋白質上的一個點突變會造成對蛋白質結構和功能的巨大影響鐮刀狀細胞貧血?。⊿ickle-CellAnemia）基因變異直接影響蛋白質特性，表現(xiàn)出不同遺傳性狀。例如人的鐮形紅血球貧血癥。紅血球碟形HbA

HbS

突變

HbC

紅血球鐮刀形血紅蛋白分子有四條多肽鏈：兩條α鏈(141個氨基酸/條)；兩條β鏈(146個氨基酸/條)。

HbA、Hbs

、Hbc氨基酸組成的差異在于β鏈上第6位上氨基酸（亞基完全相同）：

HbA第6位為谷氨酸（GAA、GAG)；

HbS第6位為纈氨酸（GUA、GUG)；

HbC

第6位為賴氨酸（AAA、AAG）由于鏈一個氨基酸的突變（6Glu6Val），去氧血紅蛋白S的表面換成了一個疏水側鏈，進一步引起分子發(fā)生線性締合，形成長鏈，多條長鏈進一步聚集成多股螺旋的不溶性纖維。HbS與HbA的四級結構差別不大，但在低氧（脫氧）時，HbS的溶解度急劇下降（為正常脫氧Hb的1/25）。產(chǎn)生貧血癥的原因：

單個堿基的突變引起氨基酸的改變導致蛋白質結構發(fā)生變化，直接產(chǎn)生性狀變化。正常碟形紅血球轉變?yōu)殓牭缎渭t血球缺氧時表現(xiàn)貧血癥。HbA

HbS

HbC蛋白質結構與功能的

關系及其研究方法X-Ray衍射NMR(核磁共振)MolecularModelingMutation/Function(分子生物學)結晶困難分子量不能太大理論不太完善費時費力內(nèi)容1、免疫體系中分子間的識別機制2、DNA與蛋白質的相互作用3、蛋白水解酶與疾病4、膜蛋白、受體與信號轉導5、酶抑制劑與藥物開發(fā)6、新技術與新方法

免疫體系分子的相互識別HelperTcell

--免疫體系的關鍵細胞

輔助T細胞巨噬細胞-吞噬抗原-加工抗原-遞呈給休止的輔助T細胞-輔助T細胞被活化-（1）激活免疫系統(tǒng)攻擊已識別的抗原；（2）激活B細胞；（3）增生殺傷T細胞MHCIIKillerTCell

--保衛(wèi)我們的主要戰(zhàn)士殺傷T細胞對抗入侵細胞的衛(wèi)士，但必須激活，首先要識別和結合特定的抗原片段-遞呈抗原-MHCI-激活的殺傷T細胞進攻帶有識別抗原的病毒并消滅之。MHCI兩種T細胞上的MHC分子是特異性識別的關鍵主要組織相容性復合體

(MajorpatibilityComplex，MHC) 早期從組織器官移植實驗中發(fā)現(xiàn)，也是當今免疫遺傳學的主要內(nèi)容。已發(fā)現(xiàn)，在人群或同種動物不同個體間進行皮膚移植時出現(xiàn)的排斥反應，具有記憶性、特異性和可轉移性等免疫反應的基本特征，故從廿世紀40年代起就確認移植排斥反應是一種典型的免疫現(xiàn)象。引起排斥反應的抗原稱移植抗原(transplantationantigen)或組織相容性抗原(patibilityantigen)。此等抗原存在于細胞表面，無器官特異性，不同個體間其抗原特異性互不相同，但同卵雙生及純系動物不同個體之間，其抗原特異性完全一致。Ⅰ類分子構槽(A)和Ⅱ類分子構槽(B)示意圖人類白細胞抗原(humanleucocyteantigen，HLA)。HLAI類分子HLAII類分子MHCIⅠ類抗原分子頂部α1和α2區(qū)組成的抗原肽結合區(qū)呈溝槽狀結構，α1和α2區(qū)各含4股β片層和1個α螺旋，呈對稱排列而連接成一個溝槽，β片層組成槽底，其兩側由α螺旋組成。溝槽大小為2.5nm×1.0nm×1.1nm，可容納8-12個氨基酸殘基組成的短肽。溝槽內(nèi)氨基酸變化大，是Ⅰ類抗原多態(tài)性的基礎。雖然抗原肽與Ⅰ類分子的結合有一定的選擇性，但并不像抗原與抗體那樣高度特異地結合，只要被結合的多肽有2-3個關鍵的氨基酸能恰當?shù)剡B接到溝槽內(nèi)的多肽結合基序(bindingmotif)的相應位置上，多肽即可與之結合，并被運送到細胞表面遞呈給T細胞。所以每個Ⅰ類抗原分子能與一定廣度的多肽譜結合。α鏈由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)可進一步分為α1、α2和α3三個功能區(qū)?？缒^(qū)含疏水性氨基酸，排列成α螺旋跨越脂質雙分子層。胞內(nèi)的氨基酸被磷?；笥欣诩毎庑畔⑾虬麅?nèi)傳遞。β2m無同種特異性，與α3功能區(qū)連接，其功能為有助于Ⅰ類抗原的表達和穩(wěn)定性。MHC1分子的結構容納抗原的口袋MHCII，α1和β1區(qū)各自盤繞成一個α螺旋和β片層構成溝槽的一個側壁和半個底面。由于它的末端是開放的，故可容納較長的多肽(約12-20個氨基酸)。該溝槽與多肽結合的特點基本上與Ⅰ類抗原相似，但被結合的多肽一般來自外源性抗原經(jīng)加工處理降解的產(chǎn)物。。Ⅱ類抗原是由Ⅱ類基因編碼的α鏈(34kD)和β鏈(29kD)非共價連接的糖蛋白。α鏈和β鏈在內(nèi)質網(wǎng)分別合成后，很快與第3條鏈—γ鏈(或稱Ii鏈)結合成αβγ復合體，當復合體到達（內(nèi)體/溶酶體樣結構)，γ鏈解離、降解。γ鏈的存在，使α、β鏈不能與其他胞內(nèi)蛋白結合，并協(xié)助αβ復合體轉運到MHC，使之與抗原結合。α鏈和β鏈，均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)各含兩個功能區(qū)α1、α2和β１、β2蛋白質與DNA的相互作用Helix-Turn-Helix(HTH)Helix-Loop-Helix(HLH)Zinc-fingerLeucinezipper非特異性:特異性:HistonesDNA-蛋白質相互作用的化學鍵1、氫鍵:具有識別功能蛋白質的螺旋結構常與DNA的大溝相互作用。2、疏水鍵：暴露于大溝側緣的T-CH3基團是疏水性的，可與疏水氨基酸殘基側鏈相互作用。3、離子鍵：蛋白質的帶電的氨基酸殘基的側鏈與DNA分子上的帶電基團形成離子鍵。組蛋白（Histone)

組蛋白（與DNA非特異性結合）組蛋白帶正電荷，含Arg、Lys，堿性蛋白，含量恒定，真核細胞中組蛋白共有5種，分為兩類：一類是高度保守的核心組蛋白（corehistone）包括H2A、H2B、H3、H4四種；另一類是可變的連接組蛋白（linkerhistone）即H1。核心組蛋白的結構是非常保守，特別是H4，牛和豌豆H4的102個氨基酸中僅有2個不同。核心組蛋白高度保守的原因可能有兩個：其一是核心組蛋白中絕大多數(shù)氨基酸都與DNA或其它組蛋白相互作用，可置換而不引起致命變異的氨基酸殘基很少；其二是在所有的生物中與組蛋白相互作用的DNA磷酸二酯骨架都是一樣的。

四種核心組蛋白通過C端疏水的氨基酸相互結合，N端帶正電荷的氨基酸向外伸出，與DNA分子結合，使DNA分子纏繞在組蛋白核心周圍，形成核小體。尾部含有大量Lys和Arg殘基，為組蛋白翻譯后進行修飾的部位，如乙?；⒓谆?、磷酸化等。

H1不僅具有屬特異性，而且還有組織特異性，所以H1是多樣性的。核小體的結構要點

每個核小體單位包括約200bp的DNA、一個組蛋白核心和一個H1。由H2A、H2B、H3、H4各兩分子形成八聚體，構成盤狀核心顆粒；H3、H4形成4聚體，位于顆粒中央；H2A、H2B二聚體分別位于兩側。

DNA分子以左手螺旋纏繞在核心顆粒表面，每圈80bp，共1.75圈，約146bp，兩端被H1鎖合，H1

結合20bpDNA.

相鄰核心顆粒之間為一段60bp的連接線DNA(linkerDNA)，典型長度60bp。組蛋白與DNA是非特異性結合，核小體具有自主裝性質。非組蛋白

非組蛋白是染色體上與特異DNA序列結合的蛋白質，又稱序列特異性DNA結合蛋白（凝膠遲滯電泳實驗）。包括多種參與核酸代謝與修飾的酶類、核質蛋白、骨架蛋白、基因表達和染色體結構調節(jié)蛋白等。（1）非組蛋白的特性①含有較多的Asp和Glu，酸性蛋白質；②整個細胞周期都進行合成，不象組蛋白只在S期合成，并與DNA復制同步進行；③能識別特異的DNA序列，識別信息存在于DNA本身，位點在大溝部分，識別與結合靠氫鍵和離子鍵；④具有多樣性和異質性；⑤具有多種功能，如幫助DNA分子折疊，以形成不同的結構域，從而有利于DNA的復制和基因的轉錄，協(xié)助啟動DNA復制，控制基因轉錄，調節(jié)基因表達。（2）序列特異性DNA結合蛋白的不同結構模式①螺旋-轉角-螺旋模式（HTH)

蛋白質形成對稱的同型二聚體，每個單位由20個氨基酸的小肽組成，兩個螺旋相互連接成β轉角。羧基端的螺旋負責識別DNA大溝的特異堿基信息，另一個螺旋與磷酸戊糖鏈骨架接觸。②鋅指模式

(ZincFinger)

每個鋅指單位是一個DNA結合結構域，由30個左右氨基酸殘基組成，其中一對Cys和一對His與Zn2+形成配位鍵，鋅指的C端形成

螺旋負責與DNA結合。③亮氨酸拉鏈式模式(LeucineZipper)

蛋白質肽鏈的羧基端約35個氨基酸殘基有形成a螺旋的特點，每兩圈（7個氨基酸殘基）有一個Leu殘基。螺旋一側的Leu排成一列，兩個蛋白質分子的螺旋間靠Leu間疏水作用力形成一條拉鏈狀結構。HTHMotif

最初發(fā)現(xiàn)于λ噬菌體的阻遏蛋白中，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在很多原核及真核DNA結合蛋白中存在。由兩個較短的α螺旋與其間含Gly殘基的絞鏈組成。如大腸桿菌的CAP蛋白含一HTH結構域，HTH通過DNA雙螺旋大溝識別、結合反向重復序列TGTG/CACA。蛋白質與DNA的相互作用Helix-turn-helix，HTHHTH的分子識別機制鋅指結構(ZincFingerStructure)

鋅指結構：基因調控的轉錄因子存在于致癌基因、果蠅控制發(fā)育的基因、受生長因子和分化信號誘導合成的蛋白質序列中。

鋅指區(qū)域：由四個Cys或二個Cys及二個His組成；保守序列Cys-N2-4-Cys-N12-14-His-N3-His。

鋅指蛋白：2~13個手指，各由23氨基酸組成，并由7~8個氨基酸連接；與DNA大溝結合并環(huán)繞DNA分子，大溝與特異DNA堿基互作。Zinc-finger蛋白結構特征指狀結構約含23個氨基酸殘基，鋅以4個配價鍵與4個Cys或2個Cys和2個His相結合。整個蛋白質分子可有2-9個這樣的鋅指重復單位。每一個單位可以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。如與GC框結合的轉錄因子SP1中就有連續(xù)的3個鋅指重復結構。Cys2/His2鋅指結構12AAs堿性亮氨酸拉鏈

(bZIP)

可形成蛋白質－蛋白質二聚體的亮氨酸拉鏈

(leucinezipper，LP)；具有35個氨基酸殘基，其中有4個亮氨酸，每7個氨基酸出現(xiàn)一次，形成α-螺旋時，每兩圈伸出一個亮氨酸，由亮氨酸殘基間的疏水作用力形成一條拉鏈，產(chǎn)生蛋白質二聚體； 堿性α-螺旋與DNA磷酸殘基和堿基互作，二聚體剪刀結構。Leucine-zipper的結構特征蛋白質分子的肽鏈上每隔6個氨基酸就有1個亮氨酸殘基，結果就導致這些亮氨酸殘基都在螺旋的同一個方向出現(xiàn)。兩個相同結構的兩排亮氨酸殘基就能以疏水鍵結合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負電荷的磷酸基團結合。若不形成二聚體則對DNA的親和結合力明顯降低。這類蛋白質能夠與CAAT框和病毒增強子結合，其特征就聚體形成域是能形成bZIP二聚體結構。LeucineZipper蛋白的剪刀型結合模式足跡法研究DNA結合蛋白的結合位點

DNAFootPrinting

足跡法技術用于測定與特殊蛋白質結合在DNA上的結合位點和相應的核苷酸順序。如該技術提供了RNA聚合酶與啟動子之間相互作用的信息并確定了作用位點（啟動子）的核苷酸順序。研究蛋白質在DNA上的結合位點的FootPrinting由含70RNA多聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動子蛋白水解酶與人體疾病Cardiovasculardiseases心血管疾病HemophiliaA/B血友病Programmedcelldeath/appotosis細胞凋亡Alzheimerdisease癡呆Cancermetastasis癌細胞轉移Pulmonaryemphysema/pancreatitis/arthritis

肺氣腫/胰腺炎/關節(jié)炎Parasitedisease:malaria/Tcruzain瘧疾InfluenzaA&AIDS甲型流感與愛滋病細胞內(nèi)蛋白質有確定的壽命

Proteosome是蛋白質降解的專業(yè)機構蛋白質降解的泛素—蛋白酶體途徑

泛素(ubiquitin，Ub)是76個氨基殘基組成的小分子多肽，可以以共價結合的方式與蛋白質的賴氨酸相連。蛋白質一旦接有泛素，稱為發(fā)生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在ATP的參與下被三種酶依序催化，形成蛋白質與一條泛素聚合鏈相結合的復合結構，進入蛋白酶體，然后降解為肽段。此為生物大分子在胞質中降解的泛素—蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteosomepathway)。泛素化是一個具有普遍意義的免疫生物學現(xiàn)象。蛋白質降解的泛素—蛋白酶體途徑

蛋白質泛素化系統(tǒng)由3個組分構成，一個稱為泛素激活酶E1，它可利用水解ATP釋放的能量以其Cys的巰基與泛素C端的Gly形成高能硫酯鍵。然后連接在其上的泛素被轉移到另一個泛素結合酶E2上，同時，被選中的靶蛋白與第三個組分即靶蛋白泛素連接酶E3結合。E2然后將與其連接的泛素轉移到靶蛋白上，并與靶蛋白Lys-NH2基團形成異肽鍵(isopeptidebond)，E2被釋放。選擇什么樣的蛋白質進行泛素化主要取決于E2和E3。血栓形成（Thrombosis）

活體心臟、血管內(nèi)血液的某些成分析出，凝集形成固體質塊的過程稱血栓形成，形成的固體質塊叫血栓。內(nèi)膜損傷后血小板粘集，形成血小板小堆；以后內(nèi)源性凝血系統(tǒng)、外源性凝血系統(tǒng)激活，形成纖維蛋白，血小板與纖維蛋白等形成血小板血栓，阻礙血流，血流下游形成漩渦，形成新的血小板血栓，如此往復形成不規(guī)則梁索狀或珊瑚狀突起，稱為血小板小梁，在小梁間則由網(wǎng)有大量紅細胞的纖維蛋白網(wǎng)填充。后血栓逐漸增大，阻塞血管，血流停止，血液發(fā)生凝固，形成更大血栓。血栓形成與消除1.溶解吸收

2.機化→再通

3.軟化脫落→栓子→栓塞→梗死組織型纖溶酶原激活劑纖溶酶原激活物抑制物血纖維蛋白溶酶原溶纖酶甲型流感病毒與艾滋病毒流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是引起流感的病原體。流感是一種上呼吸道急性傳染病，它傳染性強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高。已引起數(shù)次世界性大流行，僅1918～1919年的世界大流行，死亡人數(shù)就達2000萬，對人類的生命健康危害極大。InfluenzaVirus流感病毒（Influenzavirus）屬正粘液病毒科，流感病毒屬，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原變異性最強，感染人類和其他動物，引起中、重度疾病，侵襲所有年齡組人群，常引起世界性大流行。乙型變異性較弱，僅感染人類，一般引起輕微的疾病，主要侵襲兒童，可引起局部爆發(fā)。丙型抗原性比較穩(wěn)定，僅引起嬰幼兒感染和成人散發(fā)病例。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為15個亞型（H1～H15），N有9個亞型（N1～N9）。其中僅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人類，其它許多亞型的自然宿主是多種禽類和動物。其中對禽類危害最大的為H5、H7和H9亞型毒株。LifeCycleofInfluenzaAvirusA型流感病毒的H抗原蛋白的結構域受蛋白水解酶活化后才有感染細胞的能力艾滋?。ˋIDS)艾滋病的醫(yī)學全稱是“獲得性免疫缺陷綜合征（AcquiredImmunodeficiencySyndrome，縮寫AIDS）”，其病原為“人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，縮寫HIV）”。HIV專門攻擊人體的T淋巴細胞，致使人體免疫功能缺陷，進而導致人體喪失了對各種病原體的抵抗能力而發(fā)生多種機會性感染、惡性腫瘤和多系統(tǒng)損害的綜合征，最終導致死亡。外界環(huán)境中的生存能力較弱，對物理因素和化學因素的抵抗能力較低。對熱很敏感，56℃處理30min可使其在體外對人的T淋巴細胞失去感染性，但不能完全滅活血清中的HIV，100℃處理20min可將其完全滅活。除此之外，75%的酒精也可滅活，但紫外線不能滅活。變異強：艾滋病毒的變異性很強，給研制預防性疫苗和治療性藥物帶來了極大困難。易感性：人群普遍易感，無國界、無季節(jié)性。HIV感染與人類的行為密切相關，如：多性伴、吸毒等。AIDS病毒生活史有個必須的Protease癌細胞的轉移需要蛋白水解酶的幫助膜蛋白、受體與信號轉導白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)

細胞來源:主要由單核巨噬細胞、Th2細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生。主要功能

（1）刺激活化Ｂ細胞增殖，分泌抗體；

（2）刺激Ｔ細胞增殖及CTL活化；

（3）刺激肝細胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應；

（4）促進血細胞發(fā)育。白介素-6(Interleukin-6)的信號轉導纖維細胞生長因子（FGFs）

主要來自牛腦和腦垂體的提取液，是大約150個氨基酸結構的酸性或堿性成纖維細胞生長因子（FGF：FGF1或FGF：FGF2），氨基酸的同源性為20%~50%。其后分離的癌基因產(chǎn)物的細胞增殖因子與上述FGFs結構類似，也被分類在FGFs家族，并依次命名為FGF3~9。目前已發(fā)現(xiàn)23種FGFs。

FGFs作為細胞間信號分子在胚胎發(fā)生和分化過程中起重要作用。FGF的信號轉導幾條信號轉導途徑酶抑制劑與藥物開發(fā)真正意義上的抗流感病毒藥物ZanamivirSialicacidGS4104NA抑制劑類藥物扎那米韋（Zanamivir，瑞沙）

GG167（Glaxo），為神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制物，主要用于早期流感(發(fā)病兩天內(nèi))治療，尚未被批準用于流感預防。對甲、乙型流感均有效。然而，對具有合并癥的流感療效較差，對全身性感染幾乎無效。1999年美國政府正式批準其使用。奧司他韋（Oseltamivir，Tamiflu，達菲)

一種有效的抗病毒藥物，用于由A型流行性感冒和B型流行性感冒病毒感染導致的流感的預防和治療。是流感病毒神經(jīng)氨酸酶(Neuramindase)的特異性抑制劑，通過抑制神經(jīng)氨酸酶的作用,抑制成熟的流感病毒脫離宿主細胞，從而抑制流感病毒在人體內(nèi)的傳播，而起到預防和治療流行性感冒的作用。Oseltamivir本身屬于前體藥（Prodrug），在肝臟內(nèi)被水解后產(chǎn)生的活性代謝物自由羥基Oseltamivir才是神經(jīng)氨酸酶抑制物。Oseltamivir分子結合在神經(jīng)氨酸酶活性中心的X光衍射3維晶體圖金剛烷(Amantadine)的結構作用于MatrixProtein2(M2)蛋白鹽酸金剛乙胺井岡烷胺作用于DNA聚合酶的抗病毒藥物病毒DNA聚合酶的抑制劑，真核生物的DNA聚合酶不敏感阿昔洛韋更昔洛韋噴昔洛韋法昔洛韋嘌呤核苷類似物，轉變?yōu)橄鄳娜姿岷塑账?，參入復制到DNA，導致鏈終止，抑制DNA依賴的DNA聚合酶活性。嘧啶核苷類似物，抑制病毒DNA復制，進而導致RNA合成受阻，感染細胞DNAPol是其作用的靶部位。(E)-5-(2-溴乙烯基)-2'-脫氧尿苷氟阿糖碘胞苷氟碘阿糖尿嘧啶S-9-（3-羥基-2-磷酰基甲氧丙基）腺嘌呤西多福韋（嘌呤類）抗AIDS病毒

的藥物（I）膦甲酸作用機制為直接抑制病毒特異的DNA多聚酶和逆轉錄酶碘脫氧尿苷利巴韋林阿糖腺苷疊氮胸苷扎西他濱2,3-二脫氧胞苷去羥肌苷二脫氧肌苷核苷類抗AIDS藥物作用原理HIVprotease

作用于AIDS病毒專有的蛋白水解酶抗AIDS病毒的藥物（II）Viracept(Nelfinavir,Agouron,1998)Crivivian(Indinavir,Merck,1997)Invirase(Sequinavir,Roche,1995)Norvir(Ritonavir,Abbot,1997)茚地那韋利托那韋奈非那韋沙喹納韋計算機輔助藥物設計

是新藥研發(fā)的制高點特別適合抗結核病，抗愛滋病毒等藥物的研發(fā)Aspirin(水楊酸)的作用靶位COX1和COX2計算機設計的Celecoxib只抑制COX2抗病毒感染藥物的開發(fā)抗癌藥物的研究動態(tài)化療（Chemotherapy）藥物抗轉移藥物單克隆抗體藥物血管生成抑制藥物免疫增強藥物增敏藥物基因治療腫瘤疫苗PEG化的Asparaginase,等化療藥物講究靶向特異性MMP（基質金屬蛋白酶）inhibitorCdk（周期素依賴性激酶）2/cdk4inhibitor,EGFR/KInhibitorPoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitorGlycinamideRibonucleotideformyltransferase(GRFT)inhibitorTelomerase（端粒酶）inhibitorappotosisblockerinhibitorArtemisinin(青蒿素),等等新方向與新技術1、Proteomics2、Proteinchips3、Display/molecularevolutionengineering4、Two-hybridsystem5、Geneknockoutmice

WhatisProteomics?

(Genome+Protein

=proteinsexpressedbyagenome)一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質ProteomeandProteomics

蛋白質組是澳大利亞學者Williams和Wilkins于1994年首先提出。對應于基因組的所有蛋白質構成的整體，不是局限于一個或幾個蛋白質。同一基因組在不同細胞、不同組織中的表達情況各不相同。在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。

蛋白質組學指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學，其目的是從整體的角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。

發(fā)展簡史

1994年，澳大利亞學者Williams和Wilkins首先提出蛋白質組。

1996年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質組研究中心。

NCI投資1000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質組數(shù)據(jù)庫。

NCI和FDA共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質組數(shù)據(jù)庫。英國建立三個蛋白質組研究中心對已完成或即將完成全基因組測序的生物體進行蛋白質組研究。

Celera公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定和分類匯總人類組織、細胞和體液中的蛋白質及其異構體，構建新一代的蛋白質表達數(shù)據(jù)庫的工作。

1997年召開了第一次國際“蛋白質組學”會議

1998年在美國舊金山召開了第二屆國際蛋白質組學會議

1999年1月在英國倫敦舉行了應用蛋白質組會議

1998年，我國也于啟動了蛋白質組學研究

2003，成立了中國人類蛋白質組組織，03-04召開國內(nèi)第二及第三屆蛋白質組學會議及國際蛋白質組學大會，并將其納入863及973發(fā)展規(guī)劃。FunctionalanalysisState1State22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabasesearchDifferentialanalysis?PMF:peptideMassFingerprinting(肽質量指紋圖譜）蛋白質組學的重要技術雙向凝膠電泳（2-DE）以質譜為代表的蛋白質鑒定技術，樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。

LC（分離）-MS（分子量）/MS（部分序列）多維色譜技術『LC/LC-MS/MS』，根據(jù)蛋白質帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復合物。肽質譜指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋。生物信息學分析。質譜分析法（Spectrometry）質譜分析法是通過對被測樣品離子的質荷比的測定來進行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運動行為的不同，把離子按質荷比（m/z）分開而得到質譜，通過樣品的質譜和相關信息，可以得到樣品的定性定量結果。MSidentifiesanalytesby:ProducinggasphaseionsSeparatingtheseionsaccordingtom/zratioDetectingtheionsSensitive:Detectattomole(10-18)concentrations質譜是分子離子及碎片離子的質量與其相對強度的譜,譜圖與分子結構有關。質譜是唯一可以給出分子量,確定分子式的方法,而分子式的確定對化合物的結構鑒定是至關重要的。離子化的方法電子轟擊電離

ElectronImpactIonization,EI化學離子化ChemicalIonization,CI場電離，場解吸FieldIonizationFD,FieldDesorption，F(xiàn)D快原子轟擊

FastAtomBombardment,FAB基質輔助激光解析電離

Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI電噴霧電離

ElectrosprayIonization,ESI大氣壓化學電離

AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI聯(lián)合技術精確鑒定蛋白質技術組織切片或印片原位質譜分析技術

兩級飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉換-回旋共振質譜（FTMS）表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）基質輔助激光解析電離

Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization

(MALDI)MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到離子。待測物質的溶液與基質的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質成為晶體或半晶體，用一定波長的脈沖式激光進行照射時，基質分子能有效的吸收激光的能量，使基質分子和樣品分子進入氣相并得到電離。MALDI適用于生物大分子，如肽類、核酸類化合物?？傻玫椒肿与x子峰，無明顯碎片峰。此電離方式特別適合于飛行時間質譜計。飛行時間質量分析器

MassAnalysers:TimeofFlight(TOF)Developedin1950’sPopularisedin1980’sAdvantage:nouppermasslimitDisadvantage:poorresolutionR?2-5,000Timebetweeniongeneration&detectionApproximately10-7secondsVeryfastelectronicsrequiredVerylowmaintenanceItisjustanemptytube!飛行時間質量分析器SchematicDiagramofaTOFIonsacceleratedbyelectricfieldAllowedtodrifttodetector傅立葉變換質譜計

FourierTransform–MassSpectrometer,FT-MS

傅立葉變換質譜計是傅立葉變換離子回旋共振質譜計，是受FT-NMR的啟迪。利用不同m/z的離子，在磁場的作用下，各自產(chǎn)生不同的回旋頻率。若施加一射頻場，使其頻率等于某一m/z離子的回旋頻率，則離子就會吸收能量而激發(fā)。離子從射頻場吸收能量，稱之離子的回旋共振。激發(fā)的離子運動速度(v)增大，運動軌道半徑(r)增大，稱之離子的回旋運動的激發(fā)。

如果磁場強度（B）一定，改變射頻場的頻率（）即可激發(fā)不同m/z的離子而得到質譜。

FT-MS的核心為分析室，分析室由三對平行的極板構成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋運動垂直于z軸，在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸方向垂直的兩極板上檢測信號。

FT-MS分辨率極高，目前可得到精確度最高的精確質量。

FT-MS靈密度高，質量范圍寬，速度快，性能可靠。生物芯片(Biochip)的定義生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織的微點陣(microarray）。生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗體芯片、細胞芯片、組織芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片、組織芯片。研究歷史(ResearchHistory)1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻與光化學技術、多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNAChip概念Stanford大學Brown實驗室：預先合成，機械手陣列1995Schena等：基因表達譜1996Chee等：DNA測序1996Cronin等：突變檢測1996Sapolsley&Lipshutz：基因圖克隆1996Shalon等：復雜DNA樣本分析1996Shoemaker等：缺省突變定量表型分析根據(jù)應用的分類基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結核桿菌)法醫(yī)鑒定(如DNA指紋圖譜)表達譜芯片腫瘤相關基因(正常與腫瘤組織表達差異)藥物篩選(培養(yǎng)細胞藥物刺激前后表達差異)發(fā)育(同一組織不同發(fā)育時期基因表達差異)組織發(fā)生(不同組織或器官的基因表達差異)什么是生物芯片技術？以微點陣排列技術（MicroarrayTechnology）將生物大分子固定到適當?shù)墓腆w載體上，方便各種生化和分子生物學的操作。蛋白質芯片（ProteinChips，ProteinArray）技術基本原理：將高度密集排列的蛋白質分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析。依據(jù)的雜交反應原理:抗原-抗體反應配體-受體反應蛋白質-蛋白質相互作用蛋白質芯片的操作過程1.將抗原或抗體交聯(lián)（UV）或吸附在膜上；2.抗體或抗抗體標記示蹤①酶：HRPO、AP②膠體金③熒光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻膽蛋白等3.檢測標本中的抗體或抗原點抗原測抗體點抗原測抗體點抗體測抗體-捕獲法點抗體測抗原蛋白質芯片篩選新藥的原理受體、酶的微點陣與中草藥抽提物反應后再與受熒光標記的配體或底物結合以激光進行檢測不出現(xiàn)熒光的點表明中草藥樣品中含有與這些點上的蛋白質相互作用的物質，因此是作用于這些位點的新藥候補熒光基因芯片操作程序經(jīng)典的DNA芯片數(shù)據(jù)DNA芯片的操作過程利用半導體技術的DNA芯片酵母雙雜交(YeastTwoHybrid)

技術

蛋白質和蛋白質的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎。隨著分子生物學技術的發(fā)展，特別是人類基因組計劃的完成，使人類對基因的結構和功能的認識不斷加深，但基因編碼的蛋白質的功能研究尚是一個難題。酵母雙雜交系統(tǒng)利用酵母遺傳學方法分析蛋白質之間的相互作用，該方法建立以來，經(jīng)過不斷的完善和發(fā)展，不但可以檢測已知蛋白質之間的相互作用，更重要的在于發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白相互作用的未知蛋白質。酵母雙雜交的原理利用酵母作為真核蛋白質相互作用的模型利用誘餌質粒篩選文庫或者單個已知蛋白通過報告基因的轉錄鑒定蛋白的相互作用使用不同的培養(yǎng)基篩選陽性克隆酵母雙雜交體系

酵母雙雜交由Fields等在1989年提出，是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究。GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結構域，位于N端1-174位氨基酸殘基區(qū)段的DNA結合域(DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉錄激活域(Activationdomain，AD)。DNA-BD能夠識別位于GAL4效應基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS)，并與之結合。而AD則是通過與轉錄機構(transcriptionmachinery)中的其他成分之間的結合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉錄。DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現(xiàn)完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白質－蛋白質的相互作用。主要有二類載體:a.含DNA-bindingdomain的載體;b.含DNA-activatingdomain的載體。上述二類載體在構建融合基因時，測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報告株中表達，其表達產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence,NLS)，而GAL4-ad沒有。因此在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。

另一個重要的元件是報道株，報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reportergene)的重組質粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點:〈1〉易于轉化、便于回收擴增質粒?！?〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。〈3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易與來源于哺乳動物的蛋白結合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉錄調控因子的DNA－結合結構域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一個基因融合到轉錄激活結構域(如GAL4-ad，VP16)。激活結構域融合基因轉入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報道基因表達(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結合作用。酵母雙雜交模型DNA-BindingDomain誘餌蛋白BaitProtein捕獲（獵物）蛋白PreyProteinTranscriptionActivatingRegionReporterGeneDNA-BindingSite模型文庫篩選的步驟將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒。將誘餌質粒轉化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母。再將文庫質粒轉化到酵母中。通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。轉基因動物TransgenicAnimals什么是轉基因動物

將克隆的外源基因注射到一個受精卵的細胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長為后代，其中的部分后代其細胞中都攜帶有轉入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動物作為種畜或種禽，培育新的純合系-轉基因動物。將特定的目的基因從某一生物體分離出來，進行擴增和加工，再導入另一動物的早期胚胎細胞中，使其整合到宿主動物的染色體上，在動物的發(fā)育過程中表達，并通過生殖細胞傳給后代。這種在基因組中穩(wěn)定整合有人工導入外源基因的動物-轉基因動物。轉基因動物的制備程序外源目的基因的制備外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞選擇獲得攜有目的基因的細胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉基因動物品系轉基因鼠的制備-微注射法1980年，Gordon等人首先報道利用顯微注射純化DNA的方法獲得了世界上第一只轉基因鼠。1982年，美國科學家使用顯微注射技術將外源的大鼠生長激素基因導入小鼠的生殖細胞，發(fā)育成的轉基因小鼠比對照鼠要大上2倍，被稱為“超級鼠”1983年先后獲得了轉基因豬、羊、雞、兔、牛等。人和鼠有百分之九十九的基因相同1987年，首次報告從轉基因鼠的乳汁中可獲得有活性的人組織纖溶酶原激活劑和羊β乳球蛋白以來，通過轉基因動物的乳汁獲得異源性蛋白成為人們考慮生產(chǎn)治療性蛋白的潛在體系。1987年，Thomas等基因定點點突變轉基因鼠誕生。1988年，USPTO批準了專利歷史上第一件哺乳動物專利—哈佛鼠專利，這是一只利用遺傳工程方法改變了特征的轉基因鼠。1989年，卡佩奇發(fā)表了里程碑式的論文，第一只基因敲除小鼠

1989年，精子介導的基因轉移方法制備轉基因鼠和轉基因豬。1991-1992，綿陽及牛乳腺生物反應器。1995年，美國學者secheler建立轉基因鼠動物模型。1997年，Wilmsut等克隆綿羊（Dolly)1999年，基因打