蛋白質(zhì)公開(kāi)課課件

第三章蛋白質(zhì)第一節(jié)

蛋白質(zhì)概論一、

蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類(lèi)1、

元素組成碳50%氫7%氧23%氮16%硫0-3%微量的磷、鐵、銅、碘、鋅、鉬凱氏定氮：粗蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.252、

氨基酸組成蛋白質(zhì)是由20種L-型α氨基酸組成的長(zhǎng)鏈分子3、

分類(lèi)（1）

按組成：簡(jiǎn)單蛋白：結(jié)合蛋白：詳細(xì)分類(lèi)，P75表3-1，表3-2。（注意輔基的組成）。（2）、按分子外形的對(duì)稱(chēng)程度：球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)、膜蛋白質(zhì)（3）、按功能分：酶、運(yùn)輸?shù)鞍?、營(yíng)養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、防御蛋白。二、

蛋白質(zhì)的大小與形狀少于50個(gè)aa的低分子量aa多聚物稱(chēng)為肽，寡肽或生物活性肽，有時(shí)也罕稱(chēng)多肽。多于50個(gè)aa的稱(chēng)為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量=aa數(shù)目*110三、

蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)都有自己特有的天然空間結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為構(gòu)象。

一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸順序二級(jí)結(jié)構(gòu)：α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)卷曲三級(jí)結(jié)構(gòu)：α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、松散肽段四級(jí)結(jié)構(gòu)：多亞基聚集四、

蛋白質(zhì)功能的多樣性1．

酶2．結(jié)構(gòu)成分（結(jié)締組織的膠原蛋白、血管和皮膚的彈性蛋白、膜蛋白）3．貯藏（卵清蛋白、種子蛋白）4．物質(zhì)運(yùn)輸（血紅蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖運(yùn)輸載體、脂蛋白、電子傳遞體）5．細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（肌肉收縮的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白）6．激素功能（胰島素）7．（抗體、皮膚的角蛋白、血凝蛋白）8．接受、傳遞信息（受體蛋白，味覺(jué)蛋白）9．調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、和遺傳信息的表達(dá)（組蛋白、阻遏蛋白）第二節(jié)

氨基酸一、

蛋白質(zhì)的水解（詳見(jiàn)P79）酸水解：色氨酸破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基堿水解：消旋，色氨酸穩(wěn)定酶水解：水解位點(diǎn)特異，用于一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，肽譜二、

氨基酸的功能：（1）、組成蛋白質(zhì)（2）、一些aa及其衍生物充當(dāng)化學(xué)信號(hào)分子-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羥色胺、褪黑激素，都是神經(jīng)遞質(zhì)，甲狀腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素（3）、氨基酸是許多含N分子的前體物核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要aa（4）、一些基本氨基酸和非基本aa是代謝中間物精氨酸、瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸)尿素循環(huán)的中間物，（一）

編碼的蛋白質(zhì)氨基酸（20種）結(jié)構(gòu)通式：1、按照R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)（1）、R為脂肪烴基的氨基酸（5種）R基均為中性烷基，R基對(duì)分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點(diǎn)。（6.0±0.03）Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性從Gly至Ile，R基團(tuán)疏水性增加Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理?xiàng)l件下不解離，，但在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。

Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。★Cys的R中含巰基（-SH），具有兩個(gè)重要性質(zhì)：（1）在較高pH值條件，巰基離解。（2）兩個(gè)Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。

u

Cys與結(jié)石★Met在生物合成中是一種重要的甲基供體。（3）、

R中含有酰胺基團(tuán)（2種）酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)（4）、

R中含有酸性基團(tuán)（2種）Asp、GluAsp側(cè)鏈羧基pKa為3.86，Glu側(cè)鏈羧基pKa為4.25它們是唯一在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷的的兩個(gè)

氨基酸Lys側(cè)鏈氨基的pKa為10.53，生理?xiàng)l件下，Lys側(cè)鏈帶有一個(gè)正電荷（—NH3+），側(cè)鏈的氨基反應(yīng)活性增大。Arg是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿，pKa值為12.48，生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。His是pKa值最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35），是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。His在酶的酸堿催化機(jī)制中起重要作用在280nm處，Trp吸收最強(qiáng)，Tyr次之，Phe最弱。（6）、

芳香族氨基酸（7）、雜環(huán)族氨基酸（1種）2、按照R基的極性性質(zhì)可以分為4類(lèi)：側(cè)鏈極性(疏水性程度)Gly0Ser-0.3Glu-2.5Lys-3.0Ala0.5Asn-0.2Asp-2.5Arg-3.0Met1.3Gln-0.2

His0.5Pro1.4Thr0.4

Val1.5Cys1.0

Leu1.8Tyr2.3

Ile1.8

Phe2.5

Trp3.4

（1）、

非極性氨基酸9種在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要作用（蛋白質(zhì)的疏水核心）。（2）、

不帶電何的極性氨基酸6種這類(lèi)氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水（3）、帶負(fù)電荷的aa(酸性aa)（4）、帶正電何的aa(堿性aa)膠原蛋白中的Lys側(cè)鏈氧化時(shí)能形成很強(qiáng)的分子間(內(nèi))交聯(lián)。Arg的胚基堿性很強(qiáng)，與NaOH相當(dāng)。His是一個(gè)弱堿，是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。非極性aa一般形成蛋白質(zhì)的疏水核心，帶電荷的aa和極性aa位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys（二）

非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸也稱(chēng)修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由基本氨基酸修飾而來(lái)。（1）4-羥脯氨酸

（2）5-羥賴(lài)氨酸這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白中。

（3）6-N-甲基賴(lài)氨酸（存在于肌球蛋白中）

(4)г-羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。

（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲狀腺素（甲狀腺蛋白中）（6）鎖鏈素由4個(gè)Lys組成（彈性蛋白中）。（三）

非蛋白質(zhì)氨基酸P85不組成蛋白質(zhì)，但有生理功能（1）L-型α–氨基酸的衍生物L(fēng)-瓜氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸是尿素循環(huán)的中間物（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）。三、

氨基酸的構(gòu)型、旋光性和光吸收1、

氨基酸的構(gòu)型與旋光性Gly一種構(gòu)型,無(wú)旋光性Thr和Ile有四種光學(xué)異構(gòu)體。其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型（L-蘇氨酸）。

★氨基酸的旋光性（符號(hào)和大?。┤Q于它的R基的性質(zhì)，并與溶液的PH值有關(guān)。

P87表3-6蛋白質(zhì)中L型氨基酸的比旋光度

★外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。L-蘇氨酸和D-蘇氨酸組成消旋物。L-別一蘇氨酸和D-別-蘇氨酸組成消旋物★內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋胱氨酸有三種立體異構(gòu)體：L-胱氨酸、D-胱氨酸、內(nèi)消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物2、

氨基酸的光吸收性Tyr、Phe、Trp的R基含有共軛雙鍵，在220-300nm近紫外區(qū)有吸收。λ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103

Lambert-Beer：在280nm有最大光吸收四、

氨基酸的酸堿性質(zhì)（重點(diǎn)）1、

氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在

①晶體溶點(diǎn)高→離子晶格，不是分子晶格。②不溶于非極性溶劑→極性分子③介電常數(shù)高→水溶液中的氨基酸是極性分子。α-羧基pK1在2.0左右，當(dāng)pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，當(dāng)pH<8.0時(shí)，α-氨基以α-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0時(shí)，帶有相反電荷。2、

氨基酸的兩性解離和酸堿滴定曲線(xiàn)HA→A-+H+

pH=pKa/+Log[A-]／[HA]（1）pKa/就是HA50%解離（[堿]=[酸]）時(shí)溶液的pH值，Ka/就是此時(shí)溶液的[H+]（2）當(dāng)HA50%解離時(shí)，溶液的pH值等于pKa/（3）pH=pKa/時(shí)，[堿]=[酸]（50%解離）pH>pKa/時(shí)，[堿]>[酸]（＞50%解離）pH<pKa/時(shí)，[酸]>[堿]（＜50%解離）Ka/Ka/=[H+][A-]/[HA]在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。

起點(diǎn)：100%Gly+凈電荷：+1第一拐點(diǎn)：50%Gly+，50%Gly±平均凈電荷：+0.5pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]=pK1=2.34第二拐點(diǎn)：100%Gly±凈電荷：0等電點(diǎn)pI第三拐點(diǎn)：50%Gly±，50%Gly-平均凈電荷：-0.5pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6終點(diǎn)：100%Gly-凈電荷：-1Gly的等電點(diǎn)：★pH>pI時(shí)，氨基酸帶負(fù)電荷，-COOH解離成-COO-，向正極移動(dòng)。

pH=pI時(shí)，氨基酸凈電荷為零pH<pI時(shí)，氨基酸帶正電荷，-NH2解離成-NH3+，向負(fù)極移動(dòng)。

問(wèn)題：（1）pH=pKa/時(shí)，緩沖能力最大，等電點(diǎn)時(shí)緩沖能力最小。為什么？（2）pI的計(jì)算（氨基酸，寡肽），等電點(diǎn)時(shí)各組分的比例（3）不同pH下的電泳行為和各組分比例

（4）利用pI和pKa/確定各種氨基酸適合的酸堿緩沖范圍（5）繪制滴定曲線(xiàn)（Glu）

根據(jù)P92頁(yè)表3-7中Glu的數(shù)據(jù)（pK1α-COOH2.19，pK2α-N+H39.67，pKRR-COOH4.25，pI3.22）①繪出滴定曲線(xiàn)②指出Glu-和Glu=各一半時(shí)的pH值③指出Glu總是帶正電荷的pH范圍④指出Glu±和Glu-能作為緩沖液使用的pH范圍①解：見(jiàn)圖②Glu-和Glu=各50%時(shí)pH為9.67③pH<3.22時(shí)Glu總帶正電荷④Glu±和Glu-緩沖范圍pH4.25左右五、

氨基酸的化學(xué)性質(zhì)（一）

α-NH2參加的反應(yīng)1、與亞硝酸反應(yīng)P136VanSlyke法測(cè)定氨基酸2、

?；磻?yīng)芐氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-cl)叔丁氧甲酰氯對(duì)-甲苯磺酰氯鄰苯二甲酸酐多肽的人工合成中被用作氨基保護(hù)劑?！锏せ酋Ｂ龋―NS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽鏈—NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測(cè)定。NGly—Ala—Ser—Leu—PheC→→DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。3、

烷基化反應(yīng)α-氨基中的氮是一個(gè)親核中心，能發(fā)生親核取代反應(yīng)?！颯anger反應(yīng)

2.4一二硝基氟苯（DNFB）DNP-氨基酸，黃色，層析法鑒定，被Sanger用來(lái)測(cè)定多肽的NH2末端氨基酸★Edman反應(yīng)苯異硫氰酸酯，PITC

苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無(wú)色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來(lái)鑒定多肽的NH2末端氨基酸4、生成西佛堿的反應(yīng)（Schiff）西佛堿是某些酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物（如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物）。5、脫氨基反應(yīng)（二）

α-羧基參加的反應(yīng)①成鹽、成酯反應(yīng)P138

②成酰氯的反應(yīng)P138氨基被保護(hù)后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)，生成酰氯，使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。

3、疊氮反應(yīng)P138活化羧基，可用于肽的人工合成4、脫羧基反應(yīng)P138 Glu脫羧形成γ-氨基丁酸（三）

α-NH2和α-COOH共同參加的反應(yīng)1、

與茚三酮反應(yīng)茚三酮在弱酸中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨，脫羧反應(yīng)，最后，茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物——氨和還原茚三酮反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)（λmax=570nm）。Pro、Hy-Pro與直接形成黃色化合物（λmax=440nm）2、成肽反應(yīng)（四）

側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)——用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾（一）基于電荷性質(zhì)差異的分離方法六、

氨基酸的分離和分析1、

電泳分離

電泳的基本原理

Glu、Leu、His、Lys，4種混合樣，在pH6.0時(shí)，泳動(dòng)方向及相對(duì)速度：GluLeuHisLyspI3.225.987.599.74

2、

離子交換柱層析P152磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂氨基酸與樹(shù)脂上解離基團(tuán)之間的靜電引力氨基酸與樹(shù)脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水作用（二）基于分配系數(shù)（極性）差異的分離方法——分配層析1、紙層析P151★在流動(dòng)相中分配系數(shù)越大，移動(dòng)越快。固定相：吸附水流動(dòng)相：丁醇、醋酸、水分配系數(shù)★基本步驟：點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）2、薄層層析P152★支持劑：纖維素粉、硅膠、氧化鋁粉★基本步驟：鋪板、點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）3、分配柱層析支持劑：纖維素、淀粉、硅膠固定相：吸附水流動(dòng)相；苯酚、正丁醇固定相：涂有薄層液體的惰性顆粒流動(dòng)相：H2、N2、CO2★前提：樣品能汽化、熱穩(wěn)定（三）氣液層析（氣相層析、氣相色譜）P154分配層析、離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾層析（四）高效液相層析（HPLC）P154第三節(jié)

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

（共價(jià)結(jié)構(gòu)）一、

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)（共價(jià)結(jié)構(gòu)）：蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序(含二硫鍵)二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽主鏈中各個(gè)肽段借助于相鄰氨基酸之間的氫鍵形成的構(gòu)象。主要有α-螺旋、β折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲。超二級(jí)結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合體如αα、βαβ、βββ。結(jié)構(gòu)域：大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，彼此以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象是結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是多肽鏈的獨(dú)立折疊單位，一般由100-200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。三級(jí)結(jié)構(gòu)：整條多肽鏈或亞基通過(guò)盤(pán)旋、折疊，形成緊密的、借各種次級(jí)鍵維持的球狀構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白中亞基種類(lèi)、數(shù)目、空間排布及亞基間相互作用力。單鏈蛋白質(zhì)只有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)四級(jí)結(jié)構(gòu)。二、

肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽：一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。其中的氨基酸單位稱(chēng)氨基酸殘基。肽鍵：氨基酸間脫水后形成的共價(jià)鍵稱(chēng)肽鍵（酰氨鍵），肽單位：酰胺平面，肽單位間以α-C原子相隔，構(gòu)成肽鏈P1115肽

名稱(chēng)：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸寫(xiě)法：ＮSer-Gly--Try-AlaLeu或ＳＧＹＡＬ，★肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）酰胺氮上的孤對(duì)電子與相鄰羰基之間形成共振雜化體。（2）肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。（3）肽鍵具有平面性，組成肽鍵的4個(gè)原子和2個(gè)Cα幾乎處在同一平面內(nèi)（酰氨平面）。（4）肽鍵亞氨基在pH014內(nèi)不解離。（5）肽鏈中的肽鍵一般是反式構(gòu)型，而Pro的肽鍵可能出現(xiàn)順、反兩種構(gòu)型．★多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)酰胺平面組成P112圖3-30Pro形成的肽鏈三、

肽的重要性質(zhì)1、

旋光性一般短肽的旋光度等于其各個(gè)氨基酸的旋光度的總和。2、

肽的酸堿性質(zhì)短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。肽的酸堿性質(zhì)主要取決于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及側(cè)鏈Ｒ上可解離的基團(tuán)。在長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。pH優(yōu)勢(shì)離子的凈電荷：<3.5+23.5-4.5+14.5-7.807.8-10.2-1>10.2-2等電點(diǎn)：Pi=（4.5+7.8）/2=6.15問(wèn)題1：求出二肽Lys—Lys及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。

問(wèn)題2：把一個(gè)氨基酸結(jié)晶加入pH7.0的純水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0?還是等于6.0？（小于6.0）3、

肽的化學(xué)反應(yīng)肽的α-羧基，α-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)?！镫p縮脲反應(yīng)凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無(wú)此反應(yīng)。四、

天然存在的活性肽1、

谷胱甘肽Glu—Cys—Gly紅細(xì)胞中的巰基緩沖劑。參與氧化還原過(guò)程，清除內(nèi)源性過(guò)氧化物和自由基，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。

2GSHGS—SG

H2O2+2GSH2H2O+GS—SG2、

短桿菌肽（抗生素）由短桿菌產(chǎn)生的10肽環(huán)?？垢锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌，臨床用于治療化濃性病癥。

L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val3、

腦啡肽（5肽）Met腦啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—MetLeu腦啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu具有鎮(zhèn)痛作用。

生物體內(nèi)寡肽的來(lái)源：①合成蛋白質(zhì)的剪切、修飾②酶專(zhuān)一性逐步合成（如谷胱甘肽）、③動(dòng)物腸道可吸收寡肽4、肽類(lèi)激素★噬菌體表面展示技術(shù)與隨機(jī)多肽庫(kù)的應(yīng)用：靶功能篩選多肽藥物研究大分子之間的相互作用五、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

（一）

蛋白質(zhì)測(cè)序的基本策略對(duì)于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從N端直接測(cè)至C端，但目前只能測(cè)60個(gè)N端氨基酸。1、

直接法（測(cè)蛋白質(zhì)的序列）兩種以上特異性裂解法NCA法裂解A1

A2

A3

A4

B法裂解B1

B2

B3

B4

2、

間接法（測(cè)核酸序列推斷氨基酸序列）（二）

蛋白質(zhì)測(cè)序的一般步驟P168（1）

測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目（2）

拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。（3）

斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。（4）分析多肽鏈的N末端和C末端。

（5）

測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。（6）

多肽鏈部分裂解成肽段。（7）

測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序（8）

確定肽段在多肽鏈中的順序。（9）

確定多肽鏈中二硫鍵的位置。（三）

測(cè)序前的準(zhǔn)備工作1、

蛋白質(zhì)的純度鑒定純度97%以上，均一。⑴聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法測(cè)N端氨基酸2、測(cè)定分子量，估算氨基酸殘基數(shù)，確定肽鏈數(shù) SDS凝膠過(guò)濾法沉降系數(shù)法3、

確定亞基種類(lèi)及數(shù)目

根據(jù)分子量和N末端數(shù)SDS4、拆分多肽鏈，并分別分離純化⑴非共價(jià)鍵結(jié)合：8mol/L尿素，SDS⑵二硫鍵結(jié)合：過(guò)甲酸氧化：—S—S—+HCOOOH→SO3Hβ巰基乙醇還原5、

測(cè)定氨基酸組成酸水解的同時(shí)輔以堿水解。確定肽鏈中各種a.a出現(xiàn)的頻率,便于選擇裂解方法及試劑。6、

端基分析①N端分析★DNS-cl法：最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。

★DNFB法：Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機(jī)溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等

★PITC法：Edman法，逐步切下。無(wú)色PTH-氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析。②C端分析★肼解法無(wú)水肼NH2NH2100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游離氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法?！雉入拿阜ǎ≒ro不能測(cè)）羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、LysNH2N……………Val—Ser—GlyC圖P118羧肽酶法測(cè)C末端（四）

肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化1、

化學(xué)裂解法

①溴化氰—Met—X—產(chǎn)率85%②亞碘?；郊姿帷猅rp—X—產(chǎn)率70-100%③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—④羥胺NH2OH—Asn—Gly—約150個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次2、

酶法裂解①胰蛋白酶LysX(X≠Pro)Arg——X

②胰凝乳蛋白酶Tyr——X(X≠Pro)Trp——X

Phe——X胃蛋白酶Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)③Glu蛋白酶Glu——X（Vs蛋白酶）④Arg蛋白酶Arg——X⑤Lys蛋白酶X——Lys⑥Pro蛋白酶Pro——X3、

肽段的分離純化①電泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根據(jù)分子量大小分離②離子交換層析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根據(jù)肽段的電荷特性分離③反相ＨＰＬＣ法根據(jù)肽段的極性分離④凝膠過(guò)濾要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ單帶ＨＰＬＣ單峰Ｎ端單一（常用ＤＮＳ－cl法）（五）

肽段序列測(cè)定及肽鏈的拼接1、

Edman法（1）耦聯(lián)

PITC＋H２N—A-B-C-DpH8—9，40℃PTC——A-B-C-D（2）裂解無(wú)水三氟乙酸（TFA）ATZ—A+H2N—B-C-D（3）轉(zhuǎn)化PTH—A

PTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸）

2、

DNS-Edman法用DNS法測(cè)N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。

3、

有色Edman法熒光基-團(tuán)或有色試劑標(biāo)記的PITC試劑。4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’異硫氰酸酯。4、

用自動(dòng)序列分析儀測(cè)序儀器原理：Edman法。1967液相測(cè)序儀自旋反應(yīng)器，適于大肽段。1971固相測(cè)序儀表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。1981氣相測(cè)序儀用Polybrene反應(yīng)器。（聚陽(yáng)離子）四級(jí)銨鹽聚合物液相：5nmol20-40肽97%氣相：5pmol60肽98%6、

肽段拼接成肽鏈16肽，Ｎ端HＣ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWTＢ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS（六）二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定1、

二硫鍵的確定（對(duì)角線(xiàn)電泳法）碘乙酰胺封閉-SH胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)第一向電泳過(guò)甲酸氧化—S—S—生成-SO3H第二向電泳分離出含二硫鍵的兩條短肽，測(cè)序與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。2、

酰胺的確定Asp–Asn、Glu-Gln酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè)Asx或Glx的肽，用電泳法確定是Asp還是Asn舉例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0時(shí)，電荷量是Leu+Pro0Val-此肽除Glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gln。3、

糖、脂、磷酸基位置的確定糖類(lèi)通過(guò)Asn、Ser與蛋白質(zhì)連接，-N-糖苷-0-糖苷脂類(lèi)：Ser、Thr、Cys磷酸：Ser、Thr、His經(jīng)驗(yàn)性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)六、

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能（一）

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能

★牛胰RNase變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)：124個(gè)a.a殘基4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。

分子量：12600

(8M尿素+β硫基乙醇)變性、失活→透析后構(gòu)象恢復(fù)，活性恢復(fù)95%以上，而二硫鍵正確復(fù)性的概率是1/105。（二）

同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：①同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）②有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱(chēng)不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱(chēng)可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。③多肽鏈長(zhǎng)度相同或相近通過(guò)比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。1、

細(xì)胞色素CP182

分子量：12500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩0人與猴1人與狗10人與酵母442、胰島素●有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：A．B鏈上6個(gè)Cys不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。●其它可變氨基酸對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反應(yīng)起作用?！褙i與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。（三）

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變—分子病分子病：基因突變引起的某個(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa線(xiàn)基由正常的Glu變成了疏水性的Val

正常人血紅蛋白，β.NGlu6鐮刀型貧血β.NVal6生理?xiàng)l件下電荷：Glu-Va10

親水疏水（四）

一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活1、

血液凝固的機(jī)理凝血因子（凝血酶原致活因子）

凝血酶原凝血酶

纖維蛋白原A纖維蛋白B

凝膠（1）、

凝血酶原P133圖3-43在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324斷裂，釋放出48個(gè)a.a，產(chǎn)生活性凝血酶。A鏈49a.aB鏈259a.a（2）、

纖維蛋白原

P133圖3-44α2β2r2

從二條α鏈和二條β鏈的N端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵-Arg—Gly-，釋放出二個(gè)纖維肽A（19個(gè)氨基酸）和二個(gè)纖維肽B（21個(gè)氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。

A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

在凝血因子X(jué)IIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價(jià)?。℅ln-Lys結(jié)合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。P134上2、

胰島素原的激活P134圖3-45

※前胰島素原，含信號(hào)肽?！葝u素原，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除?！钚砸葝u素，高爾基體，切除C肽。七、

多肽與蛋白質(zhì)的人工合成P193氨基保護(hù)：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、芐氧酰氯（CBZ-Cl）、對(duì)甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）。羧基保護(hù)：芐酯、叔丁酯（成鹽、成酯）羧基活化：酰氯法（PCL5）、疊氮法、混合酸酐法、活化酯法?？s合劑：DCCI（二環(huán)己基碳二亞胺）直接接肽★多肽的固相合成支持介質(zhì)：聚苯乙烯樹(shù)脂

合成方向：C端→N端。合成程序：掛接→去保護(hù)→中和→縮合→斷裂與去保護(hù)第四節(jié)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白質(zhì)一、

多肽主鏈折疊的空間限制從理論上講，一個(gè)多肽主鏈能有無(wú)限多種構(gòu)象。但是，只有一種或很少幾種天然構(gòu)象，且相當(dāng)穩(wěn)定。因?yàn)椋禾烊坏鞍踪|(zhì)主鏈上的單鍵并不能自由旋轉(zhuǎn)1、

肽鏈的二面角★只有α碳原子連接的兩個(gè)鍵（Cα—N和Cα-C）是單鍵，能自由旋轉(zhuǎn)。

★環(huán)繞Cα—N鍵旋轉(zhuǎn)的角度為Φ環(huán)繞Cα—C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱(chēng)Ψ★當(dāng)Φ(Ψ)旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的主鏈呈順式時(shí)，規(guī)定Φ(Ψ)=0°

★從Cα沿鍵軸方向看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)的Φ(Ψ)角為正值，反之為負(fù)值。

2、

拉氏構(gòu)象圖：可允許的Φ和Ψ值Φ和Ψ同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在二面角（Φ、Ψ）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無(wú)阻礙。Cα上的R基的大小與帶電性影響Φ和ΨP206表5-3蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離?！衾蠘?gòu)象圖：Ramachandran根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離，確定了哪些成對(duì)二面角（Φ、Ψ）所規(guī)定的兩個(gè)相鄰肽單位的構(gòu)象是允許的，哪些是不允許的，并且以Φ為橫坐標(biāo)，以Ψ為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)圖上標(biāo)出，該坐標(biāo)圖稱(chēng)拉氏構(gòu)象圖。⑴實(shí)線(xiàn)封閉區(qū)域一般允許區(qū)，非鍵合原子間的距離大于一般允許距離，此區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的，且構(gòu)象穩(wěn)定。⑵虛線(xiàn)封閉區(qū)域是最大允許區(qū)，非鍵合原子間的距離介于最小允許距離和一般允許距離之間，立體化學(xué)允許，但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。⑶虛線(xiàn)外區(qū)域是不允許區(qū)，該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象，都是不允許的，此構(gòu)象中非鍵合原子間距離小于最小允許距離，斥力大，構(gòu)象極不穩(wěn)定。對(duì)非Gly氨基酸殘基，一般允許區(qū)占全平面的7.7%，最大允許區(qū)占全平面20.3％二、

二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類(lèi)型1、

α螺旋（1）、

α螺旋的一般特征：★多肽主鏈按右手或左手方向盤(pán)繞，形成右手螺旋或左手螺旋，★相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵★構(gòu)成螺旋的每個(gè)Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。典型的α螺旋有如下特征：①二面角：Φ=-57°,Ψ=-48°，是一種右手螺旋②每圈螺旋：3.6個(gè)a.a殘基，高度：0.54nm③每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，沿軸上升0.15nm④氨基酸殘基側(cè)鏈向外⑤相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。⑥肽鍵上C=O氧與它后面（C端）第四個(gè)殘基上的N-H氫間形成氫鍵。典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6個(gè)殘基13表示氫鍵封閉的環(huán)包括13個(gè)原子。

封閉環(huán)原子數(shù)=3n+4（n=1、2、）（n：后邊第n個(gè)aa）2.27螺旋（n=1）310螺旋（n=2）613螺旋（n=3）4.316螺旋（n=4）2.273103.6134.316n=1n=2n=3n=4（2）、

R側(cè)鏈對(duì)α—螺旋的影響①多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸殘基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成穩(wěn)定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。②Gly在肽中連續(xù)存在時(shí)，不易形成α—螺旋。③R基大（如Ile）不易形成α—螺旋④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。⑤R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α—螺旋。（3）、

pH對(duì)α—螺旋的影響（4）、

右手α-螺旋與左手α-螺旋右手螺旋比左手螺旋穩(wěn)定。蛋白質(zhì)中的α—螺旋幾乎都是右手，但在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）組成（φ+64°、Ψ+42°）。（5）、

α-螺旋結(jié)構(gòu)的旋光性α-螺旋結(jié)構(gòu)是一種不對(duì)稱(chēng)的分子結(jié)構(gòu)：（1）α碳原子的不對(duì)稱(chēng)性，（2）構(gòu)象本身的不對(duì)稱(chēng)性。天然α—螺旋能引起偏振光右旋α-螺旋的比旋不等于構(gòu)成其本身的氨基酸比旋的加和，而無(wú)規(guī)卷曲的肽鏈比旋則等于所有氨基酸比旋的加和。2、

β-折疊

兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈（或同一肽鏈的不同肽段）側(cè)向聚集在一起，相鄰肽鏈主鏈上的NH和C=0之間形成氫鏈，這樣的多肽構(gòu)象就是β-折疊片。（1）氫鍵與肽鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。（2）多肽主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象（3）側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。平行式：所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向。反平行式：肽鏈的極性一順一倒，N端間隔相同反平β-折疊比平行的更穩(wěn)定3、

β-轉(zhuǎn)角（β-turn）也稱(chēng)β-回折（reverseturn）、β-彎曲（β-bend）球狀蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的180°回折，由第一個(gè)a.a殘基的C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的N-H間形成氫鍵。

β轉(zhuǎn)角的特征：①由多肽鏈上4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成。②主鏈骨架以180°返回折疊。③第一個(gè)a.a殘基的C=O與第四個(gè)a.a殘基的N-H生成氫鍵④C1α與C4α之間距離小于0.7nm⑤多數(shù)由親水氨基酸殘基組成。5、

無(wú)規(guī)卷曲

沒(méi)有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)象。往往與生物活性有關(guān)α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角，β-折疊在拉氏圖上有固定位置，而無(wú)規(guī)卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允許區(qū)域內(nèi)。三、

超二級(jí)結(jié)構(gòu)由若干個(gè)相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。1、

復(fù)繞α-螺旋（αα結(jié)構(gòu)）由兩股或三股右手α-螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋。存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纖維蛋白原中。2、

βxβ結(jié)構(gòu)兩段平行式的β-折疊通過(guò)一段連接鏈（x結(jié)構(gòu)）連接而形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)。①βcβx為無(wú)規(guī)卷曲②βαβx為α-螺旋，最常見(jiàn)的是βαβαβ，稱(chēng)Rossmann折疊，存在于蘋(píng)果酸脫氫酶，乳酸脫氫酶中。3、

β曲折（β-meander）由三條（以上）相鄰的反平行式的β-折疊鏈通過(guò)緊湊的β-轉(zhuǎn)角連接而形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)。

4、

回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（希臘鑰匙）5、

β-折疊桶由多條β-折疊股構(gòu)成的β-折疊層，卷成一個(gè)筒狀結(jié)構(gòu)，筒上β折疊可以是平行的或反平行的，一般由5-15條β-折疊股組成。超氧化物歧化酶的β-折疊筒由8條β-折疊股組成。筒中心由疏水氨基酸殘基組成。6、

α-螺旋-β轉(zhuǎn)角-α-螺旋兩個(gè)α-螺旋通過(guò)一個(gè)β轉(zhuǎn)角連接在一起。λ噬菌體的λ阻遏蛋白含此結(jié)構(gòu)四、

纖維狀蛋白質(zhì)含大量的α-螺旋，β-折疊片，整個(gè)分子呈纖維狀廣泛分布于脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，起支架和保護(hù)作用。1、

角蛋白源于外胚層細(xì)胞，包括皮膚及皮膚的衍生物（發(fā)、毛、鱗、羽、甲、蹄、角、爪、絲）。α-角蛋白，β角蛋白。（1）、

α-角蛋白（毛發(fā)）主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成三股右手α-螺旋向左纏繞形成原纖維，原纖維排列成“9+2”的電纜式結(jié)構(gòu)稱(chēng)微纖維，成百根微纖維結(jié)合成大纖微。

（2）、

β-角蛋白（絲心蛋白）以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。片層結(jié)構(gòu)：反平行式β-折疊片以平行的方式堆積。鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。2、

膠原蛋白3、

彈性蛋白4、

肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白第六節(jié)

結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)

與球狀蛋白質(zhì)一、

結(jié)構(gòu)域domain，motif(模塊)在二級(jí)結(jié)構(gòu)及超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步卷曲折疊，組裝成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的、近似球形的三維實(shí)體。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位較小的蛋白質(zhì)分子或亞基往往是單結(jié)構(gòu)域的。結(jié)構(gòu)域一般有１００－２００氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連，形成所謂的鉸鏈區(qū)，使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)。結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。例如，脫氫酶類(lèi)的多肽主鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是起催化作用的結(jié)構(gòu)域，兩者組合成脫氫酶的脫氫功能區(qū)。結(jié)構(gòu)域間的裂縫，常是酶的活性部位，也是反應(yīng)物的出入口★EF手：鈣結(jié)合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix結(jié)構(gòu)★鋅指：DNA結(jié)合蛋白中，2個(gè)His、2個(gè)Cys結(jié)合一個(gè)Zn★亮氨酸拉鏈：DNA結(jié)合蛋白中，由亮氨酸倒鏈形成的拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)，二、

三級(jí)結(jié)構(gòu)：●整個(gè)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤(pán)旋、折疊，形成的特定的整個(gè)空間結(jié)構(gòu)。●三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈中所有原子的空間排布。1、

三級(jí)結(jié)構(gòu)有以下特點(diǎn)：許多在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的aa堿基在三級(jí)結(jié)構(gòu)上相距很近。球形蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很密實(shí)，大部分的水分子從球形蛋白的核心中被排出，這使得極性基團(tuán)間以及非極性基團(tuán)間的相互用成為可能。大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，2、

維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：（1）氫鍵（2）范德華力（分子間及基團(tuán)間作用力）：定向效應(yīng)：極性基團(tuán)間誘導(dǎo)效應(yīng)：極性與非極性基團(tuán)間分散效應(yīng)：非極性基團(tuán)間（3）疏水相互作用（4）離子鍵（鹽鍵）（5）共價(jià)健，主要的是二硫鍵，二硫鍵不指導(dǎo)多肽鏈的折疊，三級(jí)結(jié)構(gòu)形成后，二硫鍵可穩(wěn)定此構(gòu)象。四、球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)特征P2281、含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件2、具有明顯的折疊層次3、分子呈現(xiàn)球狀或橢球狀4、疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在外表5、表面常常有空穴，配體結(jié)合部位（活性中心）第六節(jié)、亞基締合與四級(jí)結(jié)構(gòu)

P242一、有關(guān)四級(jí)結(jié)構(gòu)的一些概念1、亞基與單體2、單體蛋白質(zhì)3、原體（protomer)☆有些對(duì)稱(chēng)的寡聚蛋白是由兩個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)的等同結(jié)構(gòu)成分組成，這種等同的結(jié)構(gòu)成分稱(chēng)為原體。如血紅蛋白α2β2就是由兩個(gè)原體αβ組成。有時(shí)也把原體稱(chēng)為單體。二、四級(jí)結(jié)構(gòu)締合的驅(qū)動(dòng)力疏水作用極性基團(tuán)之間的氫鍵和離子鍵二硫橋三、亞基之間的締合方式1、同多聚與雜多聚（homomultimericandheteromultimeric)2、同種締合與異種締合（isologusandheterologus)同種締合：亞基間相互作用的表面是相同的，形成的結(jié)構(gòu)是對(duì)稱(chēng)的P244異種締合：亞基間相互作用的表面是不同的，形成線(xiàn)形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外殼。四、四級(jí)締合在結(jié)構(gòu)和功能上的優(yōu)越性1、降低比表面積，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2、豐富蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以行使更復(fù)雜的功能。3、提高基因編碼的效率和經(jīng)濟(jì)性。4、使酶的催化基團(tuán)匯集，提高催化效率。5、形成一定的幾何形狀，如細(xì)菌鞭毛。6、適當(dāng)降低溶液滲透壓。7、具有協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)五、

寡聚蛋白與別構(gòu)效應(yīng)★別構(gòu)蛋白：除了有活性部位（結(jié)合底物）外，還有別構(gòu)部位（結(jié)合調(diào)節(jié)物）。有時(shí)活性部位和別構(gòu)部位分屬不同的亞基（活性亞基和調(diào)節(jié)亞基），活性部位之間以及活性部位和調(diào)節(jié)部位之間通過(guò)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化而相互作用?！飫e構(gòu)效應(yīng)：別構(gòu)蛋白的別構(gòu)部位與效應(yīng)物的結(jié)合改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而對(duì)活性部位產(chǎn)生的影響。★同促效應(yīng)（同位效應(yīng)）：一種配體的的結(jié)合對(duì)于其它部位結(jié)合同種配體的能力的影響，包括（正）協(xié)同效應(yīng)和負(fù)協(xié)同效應(yīng)。同位效應(yīng)一般是指活性部位之間的效應(yīng)。同位效應(yīng)是別構(gòu)效應(yīng)的基礎(chǔ)，別構(gòu)效應(yīng)可以看成`是對(duì)同位效應(yīng)的一種修飾★異促效應(yīng)（異位效應(yīng)）：就是別構(gòu)效應(yīng)，別構(gòu)部位與效應(yīng)物的結(jié)合對(duì)活性部位的影響?！镎齾f(xié)同效性：一種配基的結(jié)合促進(jìn)后續(xù)配基的結(jié)合，S型配體結(jié)合曲線(xiàn)。★負(fù)協(xié)同效性：一種配基的結(jié)合抑制促進(jìn)后續(xù)配基的結(jié)合?！镎?yīng)物：促進(jìn)活性部位與配基結(jié)合的別構(gòu)效應(yīng)物?！镓?fù)效應(yīng)物：抑制活性部位與配基結(jié)合的別構(gòu)效應(yīng)物。第七節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、

肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能：1、

肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧的蛋白質(zhì)。由一條多肽鏈（珠蛋白）和一個(gè)血紅素輔基組成。球狀分子，單結(jié)構(gòu)域。

8段直的α-螺旋組成，分別命名為A、B、C…H，拐彎處是由1~8個(gè)氨基酸組成的松散肽段（無(wú)規(guī)卷曲）。4個(gè)Pro殘基各自處在一個(gè)拐彎處，另外4個(gè)是Ser、Thr、Asn、Ile。

血紅素輔基，扁平狀，結(jié)合在肌紅蛋白表面的一個(gè)洞穴內(nèi)。

p2552、

肌紅蛋白的氧合曲線(xiàn)解離平衡常數(shù)：氧飽和度：Y=0.5時(shí)，肌紅蛋白的一半被飽和，PO2=K=P50=2torr解離常數(shù)K也稱(chēng)為P50，即肌紅蛋白一半被飽和時(shí)的氧壓。3、

Hill曲線(xiàn)和Hill系數(shù)

P257圖6-7Hill曲線(xiàn)Log[Y/(1-Y)]=0時(shí)的斜率稱(chēng)Hill系數(shù)（nH)表示配體結(jié)合部位之間在結(jié)合配體時(shí)的同促效應(yīng)。肌紅蛋白的nH=1二

血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)O21、

血紅蛋白的結(jié)構(gòu)：成人：HbA：α2β298%，HbA2：α2δ22%胎兒：HbFα2γ2早期胚胎：α2ε2▲接近于球體，4個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基?！痢ⅵ骆湹娜?jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似，2、血紅蛋白的氧合曲線(xiàn)四個(gè)亞基之間具有正協(xié)同效應(yīng)，因此，它的氧合曲線(xiàn)是S型曲線(xiàn)血紅蛋白P50=26torr，肺泡氧壓：Po2=100torr，Y=0.97

肌肉毛細(xì)血管：Po2=20torr，Y=0.25釋放氧：△Y=0.97—0.25=0.72肌紅蛋白（無(wú)協(xié)同效應(yīng)）：△Y不足0.1協(xié)同效應(yīng)可增加血紅蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地輸送氧氣。nH=1,無(wú)協(xié)同性nH＞1,正協(xié)同性nH＜1,負(fù)協(xié)同性3、

波耳效應(yīng)及其生理意義血紅蛋白上有CO2和BPG結(jié)合部位，因此，血紅蛋白還能運(yùn)輸CO2。波耳效應(yīng)：增加CO2的濃度、降低pH能顯著提高血紅蛋白亞基間的協(xié)同效應(yīng)，降低血紅蛋白對(duì)O2的親和力，促進(jìn)O2的釋放，反之，高濃度的O2也能促使血紅蛋白釋放H+和CO2。

P264圖6-17pH對(duì)血紅蛋白氧合的影響4、

BPG的別構(gòu)效應(yīng)BPG是血紅蛋白的負(fù)效應(yīng)物。BPG（2,3-二磷酸甘油酸）通過(guò)與它的兩個(gè)β亞基形成鹽鍵穩(wěn)定了血紅蛋白的脫氧態(tài)的構(gòu)象，因而降低脫氧血紅蛋白的氧親和力。

無(wú)BPG時(shí)，P50=1torr，BPG=4.5mM時(shí)，P50=26torrBPG進(jìn)一步提高了血紅蛋白的輸氧效率。在肺部，PO2超過(guò)100torr，因此，即使沒(méi)有BPG，血紅蛋白也能被飽和，在組織中，PO2低，BPG降低血紅蛋白的氧親和力，加大血紅蛋白的卸氧量。（1）高山適應(yīng)和肺氣腫的生理補(bǔ)償變化；BPG升高。（2）血庫(kù)儲(chǔ)血時(shí)加入肌苷可BPG。★協(xié)同效應(yīng)、波耳效應(yīng)、別構(gòu)效應(yīng)使血紅蛋白的輸氧能力達(dá)到最高效率三、

免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能1、

抗原與抗體★抗原是指進(jìn)入異體機(jī)體后，能致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特異結(jié)合的物質(zhì)（主要有蛋白質(zhì)、核酸及其它高分子化合物）。★抗原性包括免疫原性和抗原特異性。★免疫原性是指誘導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的能力?！锟乖禺愋允侵概c抗體特異結(jié)合的能力?！锟乖瓫Q定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化學(xué)基團(tuán)決定（一級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)），這種決定或控制抗原性的化學(xué)基團(tuán)稱(chēng)抗原決定簇?！锟乖瓫Q定簇的作用：①被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，從而激活免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體。②與相應(yīng)抗體的Fab結(jié)合?！锟贵w是在對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球蛋白，稱(chēng)免疫球蛋白?！锟贵w具有兩個(gè)特點(diǎn)：①高度特異性②多樣性幾乎所有的外源蛋白都能誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體，人體內(nèi)任一時(shí)刻約有10000種抗體存在。2、

抗原抗體反應(yīng)★抗體是2價(jià)的，抗原是多價(jià)的?！锟贵w極度過(guò)剩，抗原分子所有價(jià)被抗體的飽和，可溶。抗原一抗體比例適中，形成網(wǎng)狀的抗原—抗體復(fù)合物，不可溶?？乖瓨O度過(guò)剩，抗體被飽和，可溶。圖

★抗原抗體反應(yīng)的條件：①抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補(bǔ)。②二者各有對(duì)應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，通過(guò)作用力使二者結(jié)合（離子鍵、氫鍵等）★基于抗體-抗原相互作用的生化分析方法：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELASA）Western印跡(Westernblot)MOV:MCB4.0\IMMUNOBLOTING第八節(jié)

蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、純化、鑒定一、

蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)和等電點(diǎn)★等電點(diǎn)★等離子點(diǎn)：中性鹽（Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）影響滴定曲線(xiàn)形狀和等電點(diǎn)。鹽離子濃度為0時(shí)的等電點(diǎn)稱(chēng)等離子點(diǎn)★等電點(diǎn)測(cè)定溶解度法聚焦電泳法二、

蛋白質(zhì)的大小與形狀測(cè)分子量的方法：★化學(xué)組成法測(cè)定最低分子量★SDS法★凝膠過(guò)濾法★滲透壓法★擴(kuò)散系數(shù)法★沉降系數(shù)法和沉降平衡法1.根據(jù)分子組成測(cè)定最小分子量如肌紅蛋白含0.335%的鐵Fe分子量55.8最小M＝Fe(%)=0.335=16700

(實(shí)為16900馬心)牛血清白蛋白含Trp0.58%最低M=35200，實(shí)際為69000，含2個(gè)Trp*1002、葡聚糖凝膠過(guò)濾法分析蛋白質(zhì)分子量p297-2983.據(jù)pr的滲透壓p292用一半透膜將pr溶液與純水隔開(kāi)，當(dāng)滲透達(dá)平衡時(shí)，測(cè)定其滲透壓，計(jì)算分子量：C：濃度（克/升）R：氣體常數(shù)（0.082升/大氣壓/克分子/K開(kāi)氏溫度）T：絕對(duì)溫度（開(kāi)氏溫度）：以大氣壓表示的滲透壓4.SDS—PAGE（十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳）三、

蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與選擇性沉淀p299蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能通過(guò)半透膜）1、

穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素①蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜②非等電狀態(tài)時(shí)，同種電荷的互相排斥。③質(zhì)點(diǎn)大小在1-100nm，可以進(jìn)行布郎運(yùn)動(dòng)2、

選擇性沉淀蛋白質(zhì)的方法P300①鹽析法:大量的中性鹽[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。②有機(jī)溶劑沉淀法：破壞水化膜，降低介電常數(shù)，PEG、丙酮、乙醇等③重金屬鹽沉淀：pH＞pI時(shí)帶負(fù)電荷，與重金屬離子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）結(jié)成不溶性沉淀④生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法：pH小于等電時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類(lèi)的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：?jiǎn)螌幩?、苦味酸、鎢酸。酸類(lèi)：三氯乙酸、磺基水楊酸。⑤加熱變性沉淀。⑥等電點(diǎn)沉淀法四、

蛋白質(zhì)的變性理、化因素影響，使蛋白質(zhì)生物活性喪失。（1）變性的因素：強(qiáng)酸和強(qiáng)堿；有機(jī)溶劑：破壞疏水作用；去污劑：去污劑都是兩親分子，破壞疏水作用；還原性試劑：尿素、-硫基乙醇；鹽濃度：鹽析、鹽溶；重金屬離子：Hg2+、pb2+，能與-SH或帶電基團(tuán)反應(yīng)。溫度；機(jī)械力：如攪拌和研磨中的氣泡。（2）蛋白質(zhì)變性后，往往出現(xiàn)下列現(xiàn)象：①生物活性喪失②硫水基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易被蛋白酶水解。③溶解度降低、沉淀，粘度增加。（2）變性的實(shí)質(zhì)：次級(jí)鍵（有時(shí)包括二硫鍵）被破壞，天然構(gòu)象解體。變性不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞（5）可逆變性與不可逆變性★制備活性蛋白質(zhì)時(shí)嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。五、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則P300純化的實(shí)質(zhì)：增加制品(preparation)的純度或比活性一般程序：前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)、濃縮與保存

電泳

前處理粗分離細(xì)分離生物組織

無(wú)細(xì)胞提取液破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾疏水層析吸附層析1、前處理：①將組織和細(xì)胞破碎動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)（waringblender)勻漿器（homogenizer)超聲波處理（ultrasonication)植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨纖維素酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）②差速離心法收集細(xì)胞的某一組分（differentialcentrifugation)P209表3-20在不同離心力下沉降的細(xì)胞組分③如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。2、粗分級(jí)（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。①（NH4）2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析）②等電點(diǎn)選擇性沉淀法③有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法④熱處理選擇性沉淀法⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3、細(xì)分級(jí)（finefractionation)①透析除鹽②sephdexG-25凝膠過(guò)濾除鹽★層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）★電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤(pán)狀電泳、等電聚焦、雙向電泳★密度梯度離心4、濃縮與保存濃縮方法：保存方法：①晶體保存：結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。②凍干粉保存：③溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20~-70℃保存。六、

分離純化蛋白質(zhì)的主要方法P301★根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離★根據(jù)電荷差異分離★根據(jù)分子大小分離★根據(jù)配體特性異性分離（親和層析）★選擇性吸附分離（物理吸附）★根據(jù)疏水性的差異