第三章抗生素發(fā)酵生產工藝

第十一章

抗生素發(fā)酵生產工藝主講教師：生科院洪軍1當前1頁，總共55頁。制藥微生物生產菌種如何選育？發(fā)酵過程中主要檢測的參數(shù)有哪些？發(fā)酵工藝過程如何控制？知識回顧2當前2頁，總共55頁。主要內容抗生素的概述：（1）抗生素的定義（2）抗生素的命名（3）抗生素的分類青霉素的發(fā)酵生產工藝：（重點）（1）青霉素的概述

（2）生產菌的生物學特性

（3）發(fā)酵工藝過程

3當前3頁，總共55頁。1抗生素的定義和命名（1）抗生素的定義

早期：一般認為來源于微生物，且主要作用于細菌感染。故認為抗生素(antibiotics)是微生物在代謝過程中產的，在低濃度下就能抑制它種微生物生長和活動，甚至殺死他種微生物的化學物質。由于抗生素的這種殺菌能力，我們曾經把這類物質叫做抗菌素。4當前4頁，總共55頁?，F(xiàn)在：來源：隨著抗生素研究和生產的發(fā)展，新的抗生素的來源正在擴大?？梢允俏⑸?、植物（如蒜素、常山堿、黃連素、長春花堿、魚腥草素等）、動物（如魚素、紅血球素等）。但抗生素的工業(yè)化生產主要是來自微生物的大量發(fā)酵法，微生物是抗生素舞臺上的主角。作用對象：病毒、細菌、真菌、原生動物、寄生蟲、藻類、腫瘤細胞等。因此不能把抗生素僅僅作為抗菌藥物。

5當前5頁，總共55頁。定義：雖然抗生素已被廣泛使用，但是由于抗生素的多樣性，關于抗生素的定義在專家中一直存在著分歧。目前，一個大多數(shù)專家所接受的定義是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和動物在內）在其生命活動過程中產生的或（化學合成獲得的），能在低濃度下有選擇地抑制他種生物機能的低分子量的有機物質。狹義的定義是：抗生素是低分子量的微生物代謝產物，能在很低的濃度下抑制其他微生物的生長。6當前6頁，總共55頁。

按生物的來源：凡是在動、植物或微生物產生的，可按來源命名。如青霉素、赤霉素、蒜素按化學結構命名：化學結構性質清楚的，如四環(huán)素（含有四并苯的基本母核），氯四環(huán)素（金霉素），氧四環(huán)素（土霉素）。名稱R1R2微生物來源四環(huán)素HH金色鏈霉菌金霉素HOH金色鏈霉菌土霉素ClH龜裂鏈霉菌其它：紀念意義、產地、俗名如正定霉素、井岡霉素、金霉素和土霉素等。（2）抗生素的命名（一般分為三類）7當前7頁，總共55頁。

HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-內酰胺環(huán)RnaturalpenicillinR=CH2-CO-8當前8頁，總共55頁。β-內酰胺環(huán)苯甲異噁唑青霉素氨芐青霉素羧芐青霉素苯氧甲基青霉素9當前9頁，總共55頁。2抗生素的發(fā)展簡史2.1治療和發(fā)展我國的發(fā)展：

1953年5月1日，建立了第一個生產青霉素的抗生素工廠（上海第三制藥廠）；1958年6月3日，最大的抗生素聯(lián)合企業(yè)建成投產（華北制藥廠,石家莊），也是青霉素發(fā)酵總容積居世界首位。目前，多為原料藥基地。但在半合成及成品藥的劑型方面與國外相比差距很大。10當前10頁，總共55頁?？股貫E用的重災區(qū)中國是抗生素使用大國，也是抗生素生產大國：年產抗生素原料大約21萬噸，出口3萬噸，其余自用（包括醫(yī)療與農業(yè)使用)，人均年消費量138克左右(美國僅13克)。2011年4月7日是世界衛(wèi)生日，首屆合理用藥大會在這一天召開，恰好契合了世界衛(wèi)生日的主題——“抵御耐藥性：今天不采取行動，明天就無藥可用”。11當前11頁，總共55頁?！昂罂股貢r代”如果不再控制抗生素的濫用狀態(tài)，二十一世紀人類有可能失去抗生素這個有利的治療武器，重新回到沒有抗生素的時代，所謂“后抗生素時代”。后抗生素時代是倒退，我們可能回到沒有藥物可使用的狀態(tài)，大量的傳染性疾病將危害人類的身體健康和生命。雖然這是一種悲觀的想法，但悲觀的很有道理，細菌產生耐藥速度比新藥物開發(fā)的速度快得多，這是一個確實的現(xiàn)象。12當前12頁，總共55頁。3抗生素的分類可根據生物來源、作用對象、化學結構、作用機制、生物合成途徑等方面對抗生素進行分類。3.1根據抗生素的生物來源分類(生物學家)（1）放線菌產生的抗生素：如鏈霉素、四環(huán)類（如四環(huán)素）、大環(huán)內酯類（如紅霉素）、多烯類（如制霉菌素）

、放線菌素類（如放線菌素D）等。（其中鏈霉菌屬最多，諾卡氏菌屬、小單孢菌次之）（2）真菌產生的抗生素：如青霉菌屬和頭孢菌屬等分別產生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黃霉素、頭孢菌素）。13當前13頁，總共55頁。（3）細菌產生的抗生素：如多粘桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌等。如多粘菌素。（4）植物或動物產生的抗生素：從被子植物蒜中制得的蒜素；從動物臟器中制得的魚素等。3.2根據抗生素的作用對象分類（醫(yī)生、病理學家）（1）廣譜抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G-（2）抗G+的抗生素：如青霉素，（3）抗G-的抗生素：如鏈霉素（3）抗真菌的抗生素：如制霉菌素（4）抗病毒的抗生素：如四環(huán)類抗生素對立克次氏體及較大病毒有一定作用。（5）抗癌的抗生素：如阿霉素14當前14頁，總共55頁。3.3根據抗生素的化學結構分類（化學家）較復雜，目前已確定結構的抗生素習慣如下分類：（1）β-內酰胺類抗生素：包括青霉素類，頭孢菌素類等（2）氨基糖苷類抗生素：包括鏈霉素、慶大霉素等（3）大環(huán)內脂類抗生素：如紅霉素、麥迪加霉素（4）四環(huán)類抗生素：如四環(huán)素、土霉素（5）多肽類抗生素：如多粘菌素、桿菌肽（6）蒽環(huán)類抗生素：如阿霉素、柔紅霉素（7）喹諾酮類抗生素：如環(huán)丙沙星、諾氟沙星15當前15頁，總共55頁。3.4根據作用機制分類此種分類的優(yōu)點：便于進行理論研究，有助于了解抗生素影響病原體新陳代謝的哪些環(huán)節(jié)，從而找出治療的規(guī)律，使抗生素的使用更為合理。（1）抑制細胞壁合成的抗生素：如青霉素。（2）影響細胞膜功能的抗生素：多烯類抗生素。（3）抑制病原菌蛋白質合成的抗生素：四環(huán)素。（4）抑制核酸合成的抗生素：如影響DNA結構和功能的絲裂霉素C。（5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制電子轉移的抗霉素。16當前16頁，總共55頁。17當前17頁，總共55頁。3.5根據抗生素的合成途徑分類（1）氨基酸、肽類衍生物抗生素：如青霉素類、頭孢菌素等寡肽抗生素。（2）糖類衍生物抗生素：如鏈霉素等糖苷類抗生素。（3）以乙酸、丙酸為單位的衍生物抗生素：紅霉素等丙酸衍生物。18當前18頁，總共55頁。生產方法：1、生物合成法：

①傳統(tǒng)方法②“工程菌”制造法③細胞融合技術法

2、化學合成法；3、生物合成加化學合成法。

4抗生素的生產工藝19當前19頁，總共55頁。

1、生物合成法：

①傳統(tǒng)方法大多數(shù)抗生素是由放線菌和霉菌產生的。菌種是通過從土壤中分離、篩選獲得，一般采用深層通風攪拌發(fā)酵罐生產。傳統(tǒng)方法目前存在很多不足，因此，人們采用基因工程和細胞融合技術，對抗生素產生菌進行了改造和重新設計，不僅可以制造出許多高效低毒的新型抗生素，還可改革工藝，使抗生素產量成倍地增長。20當前20頁，總共55頁。②“工程菌”制造法

第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麥迪紫紅素A，是美國報道的。他們將產放線紫紅素的部分基因插入產麥迪霉素的放線菌中，構建的“工程菌”產生了全新的抗生素。我國新構建的生產丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素產生菌中獲得的。新的“工程菌”生產的新抗生素毒副作用小，對耐卡那霉素、慶大霉素致病菌臨床療效顯著。21當前21頁，總共55頁。③細胞融合技術法

對抗生素產生菌采用細胞融合技術的成果更為突出。橄欖色無孢小單孢菌細胞融合株抗生素產率比原菌株提高140倍。目前DNA重組技術已廣泛用于紅霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種工作，可以預見不久將來會有更多的由“工程菌”生產的新型抗生素問世。22當前22頁，總共55頁。2、化學合成法

根據某種抗生素的化學組成和結構，通過化學合成的方法，可生產部分抗生素。如：氯霉素、磷霉素等。經過化學合成方法和控制條件的不斷深入研究，越來越多的抗生素可用化學合成法生產。23當前23頁，總共55頁。3、生物合成加化學合成法

許多細菌逐漸出現(xiàn)了抗藥性，已經證實某些抗藥性因子位于細菌內的質粒上，質粒可以在細菌之間轉移，結果抗性菌日益增多，抗生素療效就越來越低。為了對付細菌的抗藥性，科學家對原有的抗生素進行了“整容手術”，細菌因再無法識別改頭換面的抗生素而被抑制或殺死。現(xiàn)在已能使用克隆了?；富虻摹肮こ叹保ù竽c桿菌）高效率的生產半合成抗生素。臨床現(xiàn)在使用的貴重特效藥物先鋒霉素（頭孢菌素類）、氨芐青霉素，就是這類半合成抗生素類藥物。國外已有幾十種這類藥物在實驗室研制成功。24當前24頁，總共55頁?？股刂苽涞囊话懔鞒虉D菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預處理及種子加濾提取及精制成品檢驗前體發(fā)酵階段提取階段成品包裝25當前25頁，總共55頁。5青霉素概述26當前26頁，總共55頁。青霉素的理化性質青霉素本身為一元酸，可與鉀、鈉、鎂、鈣、鋁和銨等化合成鹽類。易溶于水，游離酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有機溶劑。游離酸或鹽類的水溶液均不穩(wěn)定，極易失去抗菌效力。不耐熱，一般保存于冰箱中，但青霉素鹽的結晶純品，在干燥條件下可于室溫保存數(shù)年。青霉素的抗菌效力與其分子中的β-內酰胺環(huán)有關。27當前27頁，總共55頁?？咕饔煤团R床應用青霉素主要抑制G+菌，但對某些G-菌，螺旋體及放線菌也有強大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用與抑制細胞壁的合成有關。青霉素臨床上用于治療葡萄球菌傳染癥如腦膜炎、化膿炎、骨髓炎等，溶血性鏈球菌傳染癥如腹膜炎、產褥熱，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。28當前28頁，總共55頁。菌種：產黃青霉生長發(fā)育分七個階段：Ⅰ—Ⅳ期：菌絲生長期，適宜做種子；Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；Ⅵ期：菌絲體自溶期。5.1青霉素生產菌的特性點青霉29當前29頁，總共55頁。青霉素產生菌的生長過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶菌絲生長期青霉素分泌期菌絲自溶期30當前30頁，總共55頁。

第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。 第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。 第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜堿性很強。

第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體 消失，青霉素產量最高。 第6期：個別細胞自溶，胞內無顆粒，釋放氨，

pH上升。 第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。發(fā)酵培養(yǎng)下的生長過程及細胞學變化當前31頁，總共55頁。

鏡檢控制規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜種子。4－5期為生產期，生產能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產。第6期到來之前結束發(fā)酵。當前32頁，總共55頁。帶放補料工6.1青霉素生產流程結晶器種子罐1和2米孢子預處理罐過濾器發(fā)酵罐萃取器蒸發(fā)器工業(yè)鹽提煉工藝藝發(fā)冷凍干燥孢子瓊脂斜面酵

培養(yǎng)基制備無菌空氣冷至15℃6.青霉素發(fā)酵工藝過程當前33頁，總共55頁。

(1)、生產孢子制備斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，最適溫度25-26℃，培養(yǎng)6-8天，形成單菌落。再傳斜面，培養(yǎng)7天，形成綠色斜面孢子。 米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基 上，生長7天，25℃

注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試 驗，測定效價及雜菌情況。6.2青霉素發(fā)酵工藝過程當前34頁，總共55頁。(2)、種子罐培養(yǎng)工藝

一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。

培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。空氣流量1：3（體積比）；充分攪拌300-350rpm；

pH自然，溫度27±1℃,40h

二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％ 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。 通氣量1:1-1.5；攪拌250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h

質量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h當前35頁，總共55頁。(3)、生產罐培養(yǎng)工藝

三級罐：生產罐；接種量20％ 培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨， 硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.

參數(shù)條件： 通氣量1：；150-200r/min； 前60小時，26℃；

60小時后:pH6.7,24℃。當前36頁，總共55頁。6.3發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制

操作方式：反復分批式發(fā)酵 發(fā)酵罐：100m3，裝料80m3.

帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。 發(fā)酵周期：180-220h發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨以及前體物質苯乙酸鹽，補糖率是最關鍵的控制指標，不同時期分段控制。當前37頁，總共55頁。過程控制——補料分批操作控制基質濃度

前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物

40小時后：低速連續(xù)補加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。 半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產量。 碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖與6APA結合形成糖基-6APA，影響青霉素產量。當前38頁，總共55頁。a.流加碳源控制

根據殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)牵プ笥?，pH開始升高時流加糖。 葡萄糖的波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成 速度減慢或停止，過高則導致呼吸活性下降，甚至 引起自溶。

(1)培養(yǎng)基當前39頁，總共55頁。b.流加氮源控制

玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。 補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素 氨基氮濃度：0.01-0.05%。當前40頁，總共55頁。c.鹽離子控制

無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。 鐵對青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。 罐壁涂環(huán)氧樹脂保護層。當前41頁，總共55頁。d.添加青霉素側鏈前體

時期：合成階段 種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、 苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制細胞生長和青霉素合成。 策略：低濃度流加 濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%

控制：保持供應速率略大于生物合成需要。當前42頁，總共55頁。

(2).溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素25℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃當前43頁，總共55頁。(3).pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補加糖、生理酸性物質（硫酸銨、油脂）當前44頁，總共55頁。(4).溶氧控制＜30％飽和度，產率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧調整攪拌轉速:各階段的生長和耗氧量不同。當前45頁，總共55頁。(5).消沫

天然油脂：玉米油； 化學消沫劑：泡敵。 策略：少量多次。 注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。當前46頁，總共55頁。7青霉素的提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。當前47頁，總共55頁。(1)、預處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液濃度較低：10－30Kg/m3含有大量雜質：菌體細胞、核酸、雜蛋白質、細胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產物等目的：濃縮目的產物，去除大部分雜質，改變發(fā)酵液的流變學特征，利于后續(xù)的分離純化過程。預處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白當前48頁，總共55頁。

(2)、過濾鼓式真空過濾機過濾：一次濾液：，略渾，棕黃或綠色，蛋白質含量0.5-2.0%