高效液相色譜結(jié)果分析第二講

高效液相色譜結(jié)果分析第二講第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日一、色譜數(shù)據(jù)處理二、色譜圖三、色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)四、色譜峰檢測(cè)五、HPLC測(cè)定步驟與內(nèi)容第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日一.色譜數(shù)據(jù)處理檢測(cè)器記錄儀積分儀色譜工作站色譜儀信號(hào)輸出圖色譜數(shù)據(jù)處理是通過(guò)ADC轉(zhuǎn)換器,把模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào),然后采用色譜軟件處理給出色譜圖等信息。數(shù)據(jù)處理原理自動(dòng)處理人工修正

峰的檢測(cè)數(shù)據(jù)采集基線校正和重疊峰的分離

數(shù)據(jù)處理方法第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度,橫坐標(biāo)為時(shí)間二.色譜圖(Chromatogram)樣品組分分離示意圖第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三.色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(1)色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào).峰底(PeakBase):峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線.峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距離.←色譜峰時(shí)間(分)峰高峰底響應(yīng)值(mV)基線↓第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日切線峰寬(PeakWidth,峰寬):在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離.半峰寬(PeakWidthatHalfHeight):通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離

.峰面積(PeakArea):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值.三.色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(2)色譜峰的判斷(最小面積)響應(yīng)值時(shí)間峰面積切線半峰寬切線峰寬第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三.液相色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(3)保留時(shí)間(TR)(Retentiontime):組分從進(jìn)樣到出峰最大值所需的時(shí)間.死時(shí)間(t0)(Deadtime):不被固定相滯留組分的出峰時(shí)間.（其測(cè)定測(cè)定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物質(zhì)，例如：正相色譜常用四氯化碳，反相色譜常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.調(diào)整保留時(shí)間：tR’＝tR－t0第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日保留體積(VR)(Retentionvolume):組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積.死體積(V0)(Deadvolume):不被固定相滯留的組分,從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積.調(diào)整保留體積：VR’＝VR－V0＝tR’?FC

Fc:流動(dòng)相的流速mL/min.三.液相色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(4)第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日譜帶擴(kuò)展(BandBroadening):由于縱向擴(kuò)散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動(dòng)過(guò)程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象.

三.液相色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(5)第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三.液相色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(6)拖尾峰(TailingPeak):

后沿較前沿平緩的不對(duì)稱峰.前伸峰(LeadingPeak):

前沿較后沿平緩的不對(duì)稱峰.鬼峰(GhostPeak):并非由試樣所產(chǎn)生的峰,亦稱假峰.第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日Excellentt=1.0-1.05Acceptablet=1.2Unacceptablet=2Awfult=4正常前伸第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三.液相色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(7)基線(Baseline):

在正常操作條件下,僅由流動(dòng)相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào).基線噪聲(BaselineNoise):

由各種因素所引起的基線波動(dòng).基線飄移(BaselineDrift):

基線隨時(shí)間定向的緩慢變化.基線基線噪音第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日基線飄移第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日峰寬半峰寬標(biāo)準(zhǔn)偏差σ標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)(Standarddeviation):0.607倍峰高處峰寬的一半，為便于測(cè)量，改用半峰寬。目的是為了計(jì)算柱效率(柱效)。柱效（理論塔板數(shù)）：或三.液相色譜圖名詞術(shù)語(yǔ)(8)進(jìn)樣第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日?qǐng)D示中塔板數(shù)為3.

塔板理論類似蒸餾中的氣液平衡第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日峰的檢測(cè)和判別是依據(jù)在基線的訊號(hào)水平上，預(yù)設(shè)一個(gè)“閾值”，超過(guò)該值時(shí)，判別為峰可開始檢測(cè)。一般采用下面兩種方式判別峰訊號(hào)的變化：依照信號(hào)斜率的變化檢測(cè)信號(hào)依照積分面積檢測(cè)峰信號(hào)四.色譜峰檢測(cè)切線

色譜峰的判斷最小面積第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日五.HPLC測(cè)定步驟與內(nèi)容1.確定色譜條件:

色譜柱的選擇，流動(dòng)相、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫及進(jìn)樣量Ｓ等。2.繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.精密度試驗(yàn)與回收率試驗(yàn)4.實(shí)際樣品含量測(cè)定第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日1.確定色譜條件

色譜柱的選擇流動(dòng)相流速檢測(cè)波長(zhǎng)柱溫進(jìn)樣量第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2.繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線是定量分析的根本依據(jù).藥物濃度（或質(zhì)量）與藥物在檢測(cè)器上的產(chǎn)生的信號(hào)（通常采用峰面積A）成比例(正比).標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍確定取決于樣品最低濃度與最高濃度.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性一般采用5-9點(diǎn)，并非點(diǎn)越多越好!第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日準(zhǔn)確度指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。相對(duì)回收率直接反映測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值的接近程度,應(yīng)控制在100%左右(95%～105%)。絕對(duì)回收率模擬生物樣品經(jīng)整個(gè)樣品處理過(guò)程,而相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液直接分析,兩者的響應(yīng)值之比稱為絕對(duì)回收率。絕對(duì)回收率一般應(yīng)大于70%,過(guò)低說(shuō)明方法中待測(cè)物質(zhì)損失嚴(yán)重。測(cè)定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”。3.準(zhǔn)確度(accuracy)第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日(1)回收試驗(yàn)空白+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M回收率100%-=AMR空白X(2)加樣回收試驗(yàn)已準(zhǔn)確測(cè)定藥物含量P的真實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M100%X=APMR數(shù)據(jù)要求在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如高、中、低三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次.回收率第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日4.精密度(precision)精密度是指在規(guī)定條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度,表示測(cè)定的重現(xiàn)性。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(變異系數(shù)，CV)表示.(1)偏差(d）：測(cè)量值與平均值之差(2)標(biāo)準(zhǔn)(偏)差(SD或S）(3)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)(偏)差（RSD），也稱變異系數(shù)(CV,有日內(nèi)變異與日間變異兩種)第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日5.檢測(cè)限(limitofdetection,LOD)指在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，HPLC能檢測(cè)出待測(cè)物的最低濃度或含量。(是限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可).(1)信噪比法把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1時(shí)的相應(yīng)濃度或量確定檢測(cè)限。(2)非儀器分析目視法用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量.第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求。6.定量限(1imitofquantitation，LOQ)(1)信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定.(2)按1984年國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IVPAC)規(guī)定：用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定方法的實(shí)際測(cè)定下限.第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日7.專屬性(specificity,或稱選擇性）指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在的情況下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性，能反映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力，是用于復(fù)雜樣品分析時(shí)是否受到相互干擾程度的度量.8.線性（Linearity）在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度呈正比關(guān)系的程度。線形通常用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得回歸曲線的斜率（Slope）來(lái)表示。數(shù)據(jù)要求：至少需要五個(gè)濃度考察線形，需提供相關(guān)系數(shù)、y截距（檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數(shù)，應(yīng)列出回歸方程數(shù)和線性圖。第二十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測(cè)試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。范圍的確定可因測(cè)定項(xiàng)目不同而有不同要求：9.范圍（Range）

含量測(cè)定范圍為80%-120%；含量均勻度范圍為70%-130%；雜質(zhì)測(cè)定應(yīng)為被測(cè)雜質(zhì)限度的50%-120%；溶出度應(yīng)