b第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

Chapter2

TheproductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物發(fā)酵產(chǎn)酶1酶的生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillusPlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample微生物發(fā)酵產(chǎn)酶植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2Contentsofchapter21、酶生物合成過程2、常見產(chǎn)酶微生物4、酶的發(fā)酵工藝條件及控制5、酶生產(chǎn)過程的動力學6、動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶3、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式32.1酶生物合成過程ThebiosynthesisprocessofEnzyme1、中心法則-CentralDogma2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白質的生物合成-Translation4、酶生物合成的調(diào)節(jié)-RegulationGoGoGoGo下一節(jié)本章目錄4Reversetranscription1、中心法則-CentralDogma5Replication復制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。Translation翻譯：亦叫轉譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質的AA順序的過程。Reversetranslation逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，生成DNA的過程。本節(jié)目錄62、RNA的生物合成(轉錄)-Transcription細胞內(nèi)RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。(2)在蛋白質的生物合成過程中，各種RNA起著重要的作用。其中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質合成的模板，由其分子上的三聯(lián)體密碼控制蛋白質分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質生物合成的場所。(3)某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關的生化反應。(4)各種小分子RNA在分子修飾和代謝調(diào)節(jié)等方面有重要作用。7轉錄過程的特點1、轉錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉錄的模板，稱為轉錄的不對稱性。反義鏈antisensestrand（無意義鏈，負鏈）：在RNA的轉錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。2、轉錄所需酶：依賴DNA的RNA聚合酶又稱為轉錄酶，是以DNA為模板的一類RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，轉錄酶有所不同。原核生物的轉錄酶比較簡單，由1種RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3種，分別為RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為4～10個，亞基種類有4～6種。8轉錄過程起始位點的識別recognition轉錄起始initiation鏈的延伸elongation轉錄終止termination轉錄后加工modification9TheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)10本節(jié)目錄113、蛋白質的合成(翻譯)-Translation翻譯:以RNA中mRNA為模板,按照其核苷酸順序所組成的密碼指導蛋白質的合成的過程.mRNA蛋白質翻譯

各種信息各種蛋白質（核苷酸排列順序）（氨基酸排列順序）12蛋白質合成的幾個要素-mRNA(模板，template)mRNA是帶有DNA遺傳信息指導蛋白質合成的直接模板。以mRNA為模板,合成一定結構的多肽鏈的過程(翻譯)，就是將mRNA分子中的核苷酸排列順序轉變成蛋白質分子中的氨基酸排列順序。13蛋白質合成的幾個要素-遺傳密碼，nucleotidetripletcodonmRNA分子中,每三個相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息，稱為密碼子或三聯(lián)密碼。四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成43個即64個密碼子。其中：一個起始密碼:AUG三個終止密碼:UAAUGAUAG多數(shù)氨基酸擁有2-4個密碼141516蛋白質合成的幾個要素-轉運RNA(transporter)tRNA是氨基酸的轉運工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。tRNA有特異性，至少有20種以上。每種tRNA的反密碼環(huán)頂端均有由三個核苷酸組成的反密碼，能與mRNA上相應的密碼互補結合。17酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼(codon)與反密碼(anticodon)的堿基配對18蛋白質合成的幾個要素-核糖體，ribosome核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質和rRNA組成。是存在于細胞質內(nèi)的微小顆粒。19Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell沉降系數(shù)就是用來表示生物組織成分在離心力場下沉淀下來的速度大小，沉降系數(shù)越大，越先沉降20蛋白質合成的幾個要素-其他因子和酶其他輔助因子工具酶21蛋白質的合成過程肽鏈合成的起始initiation肽鏈合成的延伸elongation肽鏈合成的終止與釋放terminationandrelease合成多肽的輸送和加工transportandmodification蛋白質分子的折疊folding22氨基酸活化生成氨酰-tRNA23原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子（InitiationFactor）的參與下，核糖體30S亞基，fMet-tRNAF，mRNA和50S亞基結合，組成起始復合物的過程。主要包括5個步驟：（1）30S亞基與起始因子IF3結合；（2）30S亞基與mRNA結合，形成30S-IF3-mRNA復合物；（3）fMet-tRNAF與起始因子IF2以及GTP結合，生成fMet-tRNAF-IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的參與下，fMet-tRNAF-IF2-GTP與30S-IF3-mRNA結合生成30S起始復合物。在此30S起始復合物中，fMet-tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結合；（5）50S亞基與上述30S起始復合物結合，形成完整的70S核糖體。同時放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70S核糖體形成時，fMet-tRNAF位于70S核糖體的“P”位（肽?；唬?，而它的“A”位（氨酰基位）是空位。蛋白質合成起始24進位轉位成肽25合成終止26高效率的蛋白質合成體系27蛋白質的空間結構如何形成？功能與結構如何統(tǒng)一？體外、體內(nèi)的結構如何變化？蛋白質分子設計及蛋白質工程的需要越來越多的基因工程產(chǎn)物需要復性復活,要求蛋白質折疊的理論及技術的指導?；蚬こ讨亟M蛋白類產(chǎn)物必須要形成正確的折疊才能表現(xiàn)出功能和活性。蛋白質的折疊本節(jié)目錄28ABEX底物水平的調(diào)節(jié)酶水平的調(diào)節(jié)

酶活性的調(diào)節(jié)酶含量的調(diào)節(jié)酶的定位調(diào)節(jié)輔助因子調(diào)節(jié)生長發(fā)育的不同時期外界環(huán)境變化酶合成與分解速度的變化（基因表達調(diào)控）產(chǎn)物調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酶的調(diào)控模式4、酶生物合成的調(diào)節(jié)(regulation)29組成型酶在細胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對這些酶的合成速率影響不大。

如DNA聚合酶，RNA聚合酶，糖酵解途徑中的各種酶。適應型酶在細胞中的含量變化較大，其合成速率明顯受到環(huán)境因素的影響。適應型的酶的生物合成受到的調(diào)節(jié)控制：轉錄水平的調(diào)節(jié)、轉錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)、翻譯水平的調(diào)節(jié)、翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)和酶降解的調(diào)節(jié)。4、酶生物合成的調(diào)節(jié)(regulation)30酶在細胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細胞根據(jù)自身活動需要，嚴格控制細胞內(nèi)各種酶的合理含量，從而對各種生物化學過程進行調(diào)控。酶濃度調(diào)節(jié)的化學本質是基因表達的調(diào)節(jié)。在細胞內(nèi)，所合成的酶的種類及數(shù)量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過轉錄和翻譯而合成酶蛋白。在細胞內(nèi)進行的轉錄或翻譯過程都有特定的調(diào)節(jié)控制機制，其中轉錄的調(diào)控占主導地位。因此，基因表達的調(diào)控主要在轉錄水平上進行。31轉錄水平的調(diào)節(jié)又稱基因調(diào)節(jié)理論與酶的生物合成關系密切的基因：調(diào)節(jié)基因、啟動基因、操縱基因、結構基因。啟動基因決定酶的合成能否開始，由兩個位點組成，一個是RNA聚合酶的結合位點，另一個是cAMP與CAP組成的復合物（cAMP-CAP）的結合位點。CAP是cAMP受體蛋白或分解代謝物活化劑蛋白。只有cAMP-CAP復合物結合到啟動基因的位點上時，RNA聚合酶才能結合到其在啟動基因上的相應位點上，轉錄才有可能開始，否則酶就無法開始合成。調(diào)節(jié)基因可以產(chǎn)生一種阻遏蛋白，當阻遏蛋白與操縱基因結合時，由于空間排擠作用，RNA聚合酶就無法結合到啟動基因的位點上，也無法進入到結構基因的位置進行轉錄，因而無法將DNA上的遺傳信息轉錄到mRNA分子上，酶的生物合成無法進行。只有當阻遏蛋白與效應物結合，改變結構而不與操縱基因結合時，RNA聚合酶才能結合到啟動基因的位點上，才能開始酶的生物合成。32啟動基因、操縱基因、結構基因一起組成操縱子。在原核生物中，操縱子有兩種類型，即誘導型和阻遏型。誘導型操縱子在無誘導物的情況下，其基因的表達水平很低或不表達，只有在有誘導物的情況下，才能轉錄生成mRNA，進而合成酶阻遏型操縱子在無阻遏物的情況下，基因正常表達，當有阻遏物存在時，轉錄受到阻遏。轉錄水平的調(diào)節(jié)主要有3種模式，分解代謝物阻遏作用、酶合成的誘導作用和酶合成的反饋阻遏作用33分解代謝物阻遏作用某些物質（主要指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質阻遏某些酶（主要是誘導酶）生物合成的現(xiàn)象如葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成，果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成。添加一定量的cAMP可以減少或解除分解代謝物阻遏作用。34細菌乳糖操縱子的作用機制(分解代謝物阻遏)調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復合物mRNA當葡萄糖作唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環(huán)化酶（將ATP轉變成cAMP）有抑制作用，則cAMP的濃度降低，CAP-cAMP復合物減少，不能與啟動子結合，故轉錄不得進行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過酶-半乳糖苷乙?；D移酶酶過去稱葡萄糖效應35酶生物合成的誘導作用酶合成誘導的現(xiàn)象—JacobandMonod的工作：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實驗：

1.大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)無上述三種酶合成；

2.大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有上述三種酶合成；當換成葡萄糖培養(yǎng)基時，三種酶基本消失；

3.表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成。

本世紀三十年代，H.Karstrom在對糖代謝過程中的某些酶的合成進行研究時提出：誘導酶與組成酶加入某種物質使酶的生物合成開始或加速進行的過程，叫做酶合成的誘導。能誘導酶合成的物質叫誘導物。被誘導合成的酶叫誘導酶。36乳糖操縱子的結構無誘導物存在時，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白（lacrepressor）與操縱基因（Olac）的結合力強，結構基因無法進行轉錄，酶的生物合成受阻。37誘導機制當培養(yǎng)基中以乳糖為唯一碳源時，細胞吸收乳糖變?yōu)閯e乳糖，別乳糖作為誘導物與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白結構改變，與操縱基因結合力變?nèi)?，不再與操縱基因結合，酶的生物合成可以進行。38酶生物合成的阻遏作用酶合成阻遏的現(xiàn)象—JacobandMonod的工作：實驗：

1.大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟原則：不需要就不合成。酶生物合成的阻遏作用又稱為產(chǎn)物阻遏作用，是指酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到足額的現(xiàn)象。能阻遏酶合成的物質叫輔阻遏物。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。39調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白在沒有阻遏物存在時，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因的親和力弱，不能與操縱基因結合，結構基因能夠表達調(diào)節(jié)基因操縱基因結構基因輔阻遏物trp當環(huán)境中色氨酸濃度增加，阻遏物到達一定濃度時，阻遏蛋白與阻遏物結合，使其結構發(fā)生改變，與操縱基因結合，結構基因不能表達色氨酸操縱子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)402.2常見產(chǎn)酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction基本要求：發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高；容易培養(yǎng)和管理；產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，不易變異退化，不易被感染；利于酶的分離純化；安全可靠，無毒性。（非致病菌）：凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實驗。非常見微生物制取的酶,需做廣泛的毒性實驗,包括慢性中毒實驗。41(1)大腸埃希氏桿菌，簡稱為大腸桿菌，是最為著名的原核生物。形態(tài)：短桿或長桿狀，0.5～1.0×1.0～3.0um，革蘭氏陰性，運動(周毛)或不運動，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴展，光滑，閃光。Escherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實驗室操作、生長迅速，而且營養(yǎng)要求低。應用： 大腸桿菌能作為宿主供大量的細菌病毒生長繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等42(2)醋酸桿菌（Acetobacter）

菌體從橢圓至桿狀，單個、成對或成鏈，革蘭氏陰性，運動（周毛）或不運動，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長良好。應用：有機酸(食醋等）葡萄糖異構酶(高果糖漿)山梨糖(維C中間體）43(3)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

直狀、近直狀的桿菌，周生或側生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。44(4)根霉(Rhizopus)分類學上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質和水果、蔬菜的腐爛。代表種：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。應用：根霉能產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機酸。45(5)曲霉(Aspergillus)分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門。分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。代表種：黑曲霉Asp.Niger、黃曲霉Asp.flavus應用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種?；乇竟?jié)46酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式固體發(fā)酵液體發(fā)酵2.3微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式47固體發(fā)酵表面培養(yǎng)或曲式培養(yǎng)以麩皮、米糠等為基本原料，加入適量的無機鹽和水作為培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶微生物菌種培養(yǎng)的一種培養(yǎng)技術淺盤培養(yǎng)轉桶培養(yǎng)多用通風式厚層培養(yǎng)固體發(fā)酵技術原理48固體發(fā)酵法設備簡單，便于推廣，特別適合于霉菌的培養(yǎng)和產(chǎn)酶發(fā)酵條件不易控制、物料利用不完全、勞動強度大、容易染菌等優(yōu)點缺點不適于胞內(nèi)酶的生產(chǎn)49液體深層發(fā)酵浸沒式發(fā)酵利用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐內(nèi)進行的一種攪拌通氣培養(yǎng)方式酶制劑生產(chǎn)的主要培養(yǎng)方式原料的利用率和酶的產(chǎn)量都較高，培養(yǎng)條件容易控制液體發(fā)酵法50工業(yè)規(guī)模應用的微生物酶和它們的某些來源酶產(chǎn)酶微生物用途α-淀粉酶枯草芽胞桿菌，地衣芽胞桿菌，米曲霉淀粉液化，織物退漿，消化助劑，加酶洗滌劑葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米根霉制造葡萄糖，發(fā)酵、釀酒等工業(yè)的淀粉水解糖中性蛋白酶枯草芽胞桿菌，米曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，調(diào)味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清堿性蛋白酶地衣芽胞桿菌加酶洗滌劑植酸酶黑曲霉，畢赤酵母工程菌株飼料添加劑轉化酶啤酒酵母、假絲酵母制造轉化糖凝乳酶米赫毛霉、大腸桿菌和真菌生產(chǎn)的重組酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗滌劑，油脂加工，生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，測定葡萄糖葡萄糖異構酶凝結芽胞桿菌，白色鏈霉菌生產(chǎn)果葡糖漿青霉素?；讣毦⒚咕?、放線菌制造6-氨基青霉烷酸纖維素酶里氏木霉、黑曲霉水洗布生產(chǎn)，飼料添加劑，消化植物細胞壁半纖維素酶木霉、曲霉、根霉飼料添加劑，消化植物細胞壁，低聚木糖生產(chǎn)β-葡聚糖酶枯草芽胞桿菌，黑曲霉啤酒釀造，飼料添加劑異淀粉酶產(chǎn)氣克雷伯氏菌，芽孢桿菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉乳品工業(yè)（處理牛乳和乳清）果膠酶曲霉、歐文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻類纖維脫膠52酶無菌空氣預培養(yǎng)固定化細胞保藏細胞細胞活化培養(yǎng)基固定化原生質體原生質體發(fā)酵擴大培養(yǎng)分離純化工藝流程

2.4酶的發(fā)酵工藝條件與控制53一、細胞活化與擴大培養(yǎng)1、生產(chǎn)菌種的來源（1）購買或篩選向菌種保藏機構索取有關的菌株，從中篩選所需菌株。中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）；中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，又稱武大保藏中心）。中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（ACCC）；中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）荷蘭微生物菌種保藏中心（CBS）德國微生物菌種保藏中心（DSMZ）英國國家典型菌種保藏所（NCTC）54（2）篩選由自然界采集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。篩選步驟：①樣品的采集：主要是各種富含所需微生物的土壤、水、氣、枯枝爛葉、爛水果等。②初篩：分離產(chǎn)目的酶的菌株給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株分離出來。55-淀粉酶的篩選蛋白酶的篩選56③復篩：從所得菌株中篩選優(yōu)良株在初篩的基礎上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。④高產(chǎn)菌株的選育誘變育種、細胞雜交、原生質體融合育種、基因工程育種（3）保藏常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷凍干燥保藏法、低溫保藏法、石蠟油保藏法。572、生產(chǎn)種子的制備

生產(chǎn)種子：由原始保藏菌種，經(jīng)過活化，擴大培養(yǎng)，用于發(fā)酵罐接種的大量菌體。（1）菌種活化

目的：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下培養(yǎng)，以恢復細胞的生命活動能力。方法：在試管斜面上培養(yǎng)1～3代。58（2）擴大培養(yǎng)

目的：活化后的菌種經(jīng)過一級至數(shù)級的擴大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質細胞。培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基。59

方法：分為實驗室培養(yǎng)和車間培養(yǎng)兩個階段。擴大培養(yǎng)應注意的事項：（1）盡量減少傳代次數(shù)，以降低菌種衰退和污染的可能性；（2）培養(yǎng)基成分一般應比發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豐富；（3）培養(yǎng)時間一般控制在微生物生長的對數(shù)生長期，及時接入下一級培養(yǎng)或發(fā)酵罐；（4）嚴格控制培養(yǎng)條件（pH、溫度、通氣量等），加強培養(yǎng)過程的實時監(jiān)測。60二、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分一般包括碳源、氮源，無機鹽、生長因子等。培養(yǎng)基是指人工配制的用于細胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質的混合物。611、碳源在酶的生物合成法生產(chǎn)過程中，首先要從細胞的營養(yǎng)要求和代謝調(diào)節(jié)方面考慮碳源的選擇；此外還要考慮到原料的來源是否充裕、價格是否低廉、對發(fā)酵工藝條件和酶的分離純化是否影響等因素。不同的細胞對各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時應根據(jù)不同細胞的不同要求而選擇合適的碳源。如黑曲霉具有淀粉酶系，可以采用淀粉為碳源，而酵母不能利用淀粉，只能采用蔗糖和葡萄糖等為碳源。62

當前酶制劑生產(chǎn)使用的菌種大都是只能利用有機碳的異養(yǎng)型微生物。

有機碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質原料。

此外，以石油產(chǎn)品中12～16碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。632、氮源酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機氮源和無機氮源兩種。

常用的有機氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；

無機氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3PO4、尿素等。643、碳氮比碳氮比(C/N)指培養(yǎng)基中碳元素的總量與氮元素總量之比。有的采用碳源總量和氮源總量之比。

一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利。

淀粉酶(包括α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高。65在微生物酶生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過程不同而異。例如種子培養(yǎng)時，為了適應菌體生長繁殖的需要，種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)基低些。

發(fā)酵時，不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF-7658生產(chǎn)α-淀粉酶的發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當降低，以利菌體生長繁殖，發(fā)酵中后期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當提高，以促進淀粉酶的生成。664、無機鹽不同無機鹽在細胞的生命活動中作用不同，如主要組成元素（磷和硫），酶分子的組成元素（磷、硫、鋅、鈣），酶的激活劑（鉀、鎂、鋅、銅、鐵、錳、鈣、鉬、鈷、碘等），調(diào)節(jié)pH、氧化還原電位和滲透壓（鈉、鉀、鈣、磷、氯等）

根據(jù)細胞對無機元素需要量的不同，無機元素分為大量元素和微量元素兩大類。大量元素：磷、硫、鉀、鈣、鎂、氯等；微量元素：銅、錳、鋅、鉬、鈷、溴、碘等675、生長因子微生物還需一些微量的像維生素一類的物質，才能正常生長發(fā)育，這類物質統(tǒng)稱生長因子(或生長素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長素32~128mg/mL。68三、液體深層發(fā)酵的工藝控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。691、溫度對產(chǎn)酶的影響微生物生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質不同而異，生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細菌為37℃，霉菌和放線菌為28～30℃，一些嗜熱微生物需在40～50℃下生長繁殖，如紅曲霉生長溫度35～37℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37～40℃。70在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長和酶的合成，也有進行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.398進行中性蛋白酶生產(chǎn)時，培養(yǎng)溫度必須從31℃逐漸升溫至40℃，然后再降溫到31℃進行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。71

發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應、發(fā)酵中通風、攪拌速度的變化而變化的。細胞的新陳代謝釋放能量,通風攪拌導致發(fā)酵液升溫。同時由于熱量的不斷擴散，會導致培養(yǎng)基的溫度不斷降低。兩者決定培養(yǎng)基的溫度。

溫度調(diào)控一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。發(fā)酵罐或其他生物反應器均設計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。722、pH對產(chǎn)酶的影響不同的細胞生長繁殖的最適pH有所不同。細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH與生長最適pH往往有所不同。細胞生產(chǎn)某種酶的最適pH通常接近于該酶催化反應的最適pH。73

培養(yǎng)基的pH隨著細胞的生長、繁殖和新陳代謝產(chǎn)物的積累，往往會發(fā)生變化。一般來說，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，由于糖代謝產(chǎn)生有機酸，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。

控制pH的方法：改變培養(yǎng)基的組分和比列；使用緩沖液維持一定的pH；使用酸堿調(diào)節(jié)pH等。743、溶解氧對產(chǎn)酶的影響細胞必須獲得充足的氧氣，使從培養(yǎng)基中獲得的能源物質（一般是指各種碳源）經(jīng)過有氧降解而生成大量的細胞的生長繁殖和酶的生物合成過程需要大量的能量ATP。75◆在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞一般只能吸收和利用溶解氧。在發(fā)酵過程中必須不斷供給氧（一般通過供給無菌空氣來實現(xiàn)），使培養(yǎng)基中的溶解氧保持在一定的水平?！艏毎麑θ芙庋醯男枰颗c細胞的呼吸強度及培養(yǎng)基中的細胞濃度密切相關。可以用耗氧速率KO2表示：

KO2=QO2·Cc76◆氧的溶解速度又稱為溶氧速率或溶氧系數(shù)，以Kd表示?！羧苎跛俾逝c通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質等有密切關系?！舢斎苎跛俾屎秃难跛俾氏嗟葧r，即：K02=Kd

的條件下，培養(yǎng)液中的溶解氧的量保持恒定，可以滿足細胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的需要。77◆調(diào)節(jié)溶解氧的方法主要有：①調(diào)節(jié)通氣量②調(diào)節(jié)氧的分壓

③調(diào)節(jié)氣液接觸時間④調(diào)節(jié)氣液接觸面積⑤改變培養(yǎng)液的性質78對于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)物質與菌體均勻接觸，降低細胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細胞受損。同時攪拌也帶來一定機械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關。4、攪拌的影響795、泡沫的影響消泡措施：一般除了機械消泡外，還可利用消泡劑。理想的消泡劑，其表面相互作用力應低，而且應難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵（聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚）。80四、提高酶產(chǎn)量的措施1、添加誘導物誘導物一般可以分為3類:酶的作用底物，酶的催化反應產(chǎn)物和作用底物的類似物。2、控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)其作用機理的不同，可以分為產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。81控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施?！舴纸獯x物阻遏作用：控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度，或采用其他較難利用的碳源，如淀粉等，或者采用補料、分次流加碳源等方法，控制碳源的濃度在較低的水平。此外，在分解代謝物阻遏存在的情況下，添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP），可以解除或減少分解代謝物阻遏作用。◆末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。823、添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。表面活性劑離子型和非離子型兩大類。其中，離子型表面活性劑又可以分為陽離子型、陰離子型和兩性離子型3種。◆將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓（Triton）等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加?！粲捎陔x子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。834、添加產(chǎn)酶促進劑產(chǎn)酶促進劑是指可以促進產(chǎn)酶、但是作用機理未闡明清楚的物質。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，添加適宜的產(chǎn)酶促進劑，往往可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；842.4酶生產(chǎn)過程的動力學1、酶生產(chǎn)過程中細胞生長動力學2、酶生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶動力學3、酶生產(chǎn)過程中基質消耗動力學85酶發(fā)酵動力學發(fā)酵動力學是研究發(fā)酵過程中細胞生長速率、產(chǎn)物生成速率、基質消耗速率以及環(huán)境因素對這些速率的影響規(guī)律的學科。包括細胞生長動力學、產(chǎn)物生成動力學和基質消耗動力學861、酶生產(chǎn)過程中細胞生長動力學細胞在控制一定條件的培養(yǎng)基中生長的過程中,其生長速度受到細胞內(nèi)外各種因素的影響,變化比較復雜，情況各不相同。細胞生長動力學主要研究細胞生長速度以及外界環(huán)境因素對細胞生長速度影響的規(guī)律。KS

為莫諾德常數(shù)，是指比生長速率達到最大比生長速率一半時的限制性基質濃度。1950年，法國的莫諾德（Monod）首先提出了表述微生物細胞生長的動力學方程。他認為，在培養(yǎng)過程中，細胞生長速率與細胞濃度成正比：假設培養(yǎng)基中只有一種限制性基質，而不存在其他生長限制因素時，μ為這種限制性基質濃度的函數(shù)。87莫諾德方程是基本的細胞生長動力學方程。在發(fā)酵過程優(yōu)化以及發(fā)酵過程控制方面具有重要的應用價值。不少學者從不同的情況出發(fā)或運用不同的方法，對莫諾德方程進行了修正，得出了適用于不同情況的各種動力學模型。連續(xù)培養(yǎng)時的方程變化形式連續(xù)全混流生物反應器進行連續(xù)發(fā)酵的過程中，連續(xù)不斷流加培養(yǎng)液并連續(xù)排出相同體積的發(fā)酵液。在穩(wěn)態(tài)時，游離細胞連續(xù)發(fā)酵的生長動力學可以表達為：D為稀釋率，指單位時間內(nèi)，流加的培養(yǎng)液的與發(fā)酵容器中發(fā)酵液體積之比，一般以/h為單位。882、產(chǎn)酶動力學產(chǎn)酶動力學主要研究細胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動力學的研究可以從整個發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細胞的產(chǎn)酶速率及其影響因素，這稱為宏觀產(chǎn)酶動力學或這稱為非結構動力學。也可以從細胞內(nèi)部著眼，研究細胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產(chǎn)酶動力學或稱為結構動力學。89（1）酶生物合成的模式細胞在一定條件下培養(yǎng)生長，其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段90

根據(jù)酶的合成與細胞生長之間的關系，可將酶的生物合成分為3種模式，即：

生長偶聯(lián)型

：同步合成型和中期合成型

部分生長偶聯(lián)型：延續(xù)合成型

非生長偶聯(lián)型：滯后合成型91同步合成型

酶的生物合成與細胞生長同步進行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型。屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成；當細胞生長進入平衡期后，酶的合成隨著停止。大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導酶也按照此種模式進行生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導作用下，合成單寧酶（tanaseEC3.1.1.20）。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細胞濃度活細胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度92延續(xù)合成型

酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳