高效液相色譜法簡介

高效液相色譜法

High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC主要內(nèi)容第一節(jié)概述第二節(jié)高效液相色譜儀第三節(jié)高效液相色譜類型第四節(jié)固定相和流動相的選擇第五節(jié)圖形結(jié)果分析及其應(yīng)用第一節(jié)概述

高效液相色譜（HPLC）也叫高壓液相色譜（highpressureliquidchromatography）、高速液相色譜（highspeedliquidchromatography）、高分離度液相色譜（highresolutionliquidchromatography）等。高效液相色譜法是以液體作為流動相的色譜法，它是利用樣品中各組分在色譜柱中固定相和流動相相間分配系數(shù)或吸附系數(shù)的差異，將各組分分離后進(jìn)行定性、定量分析。發(fā)展歷史20世紀(jì)初，俄國植物學(xué)家茨維特提出經(jīng)典液相色譜法。1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末，科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。20世紀(jì)70年代，高效液相色譜法開始廣泛應(yīng)用。高效液相色譜的特點高壓——壓力可達(dá)150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1～10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。

第二節(jié)高效液相色譜儀高效液相色譜儀基本裝置流動相進(jìn)樣閥注入樣品液色譜柱檢測器色譜處理機(jī)高壓泵流出液高效液相色譜儀的組成高效液相色譜儀一般可分為四個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進(jìn)樣、餾分收集及數(shù)據(jù)處理等。1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔很小約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去（氣泡會影響檢測）。1、高壓輸液系統(tǒng)3）高壓泵

注射型泵------輸出精確，無脈動，需更換溶劑而中斷工作?！艉懔鞅?/p>

往復(fù)型泵------造價低廉，溶劑更換方便，但存在脈動。

高壓泵按排液性質(zhì)可分為：恒壓型和恒流型。對流量變化敏感的檢測器會有噪聲干擾，此時可連接一脈動阻尼器。◆恒壓泵--------壓力恒定，但流量不恒定（現(xiàn)在已經(jīng)較少使用）。（使用較多）

輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定②流量范圍寬③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150～300kg/cm2；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕。輸液泵操作注意事項：防止固體微粒進(jìn)入泵體流動相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完不超過規(guī)定的最高壓力流動相一般應(yīng)該先脫氣HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。

4）梯度淋洗裝置：梯度洗脫有兩種實現(xiàn)方式：一是高壓梯度（內(nèi)梯度），利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合均勻后再進(jìn)入色譜柱。二是低壓梯度（外梯度），通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例抽入一臺高壓泵中混合，隨后打入色譜柱。高壓梯度低壓梯度2、進(jìn)樣系統(tǒng)

早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：（1）隔膜進(jìn)樣（2）停流進(jìn)樣（3）自動進(jìn)樣（4）閥進(jìn)樣（1）隔膜進(jìn)樣。使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差，常規(guī)分析使用受到局限。（2）停流進(jìn)樣。可避免在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點是保留時間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。（3）自動進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。（4）閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。圖六通進(jìn)樣閥

分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。

色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2～6mm，柱長為10～50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。3、分離系統(tǒng)

色譜柱發(fā)展趨勢：

填料粒度小柱徑小標(biāo)準(zhǔn)柱型：4.6mm或3.9mmL:15-30cm填料粒度：5-10m裝柱技術(shù)：干法：填料粒度大于20m時可用。

濕法（勻漿法）：配成懸浮液。高壓泵壓入色譜柱，洗凈備用4、檢測系統(tǒng)檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?。要求：靈敏度高噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）線性范圍寬重復(fù)性好適用范圍廣分類：1）按原理可分為光學(xué)檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學(xué)檢測器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。2）按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。3）按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測器的響應(yīng)與流動相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān)。4）按破壞性還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。a.紫外檢測器（UD）b.熒光檢測器（FD)c.示差折光檢測器(RID）d.安培檢測器e.電導(dǎo)檢測器f.蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測器介紹a.紫外檢測器(ultravioletdetector)

UV檢測器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。檢測原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應(yīng)信號（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。專屬型、濃度型檢測器石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液（1）固定波長檢測器：254nm（2）可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈），200—400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計相似（3）光電二極管陣列檢測器

(photodiodearraydetector；PDAD)：1024個二極管陣列，一個二極管對應(yīng)接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。類型：光電二極管陣列檢測器工作原理：復(fù)光通過流通池，再進(jìn)入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時獲得各波長的信號強度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度。光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展，如圖所示。光電二極管陣列檢測器b.熒光檢測器

(fluorescencedetector；FD)檢測原理：化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光，稱為熒光；熒光強度

(F)與激發(fā)光強度

(I0)及熒光物質(zhì)濃度

(C)之間的關(guān)系為：

F=2.3QKI0εCl

Q為量子產(chǎn)率，K為熒光效率，ε為摩爾吸光系數(shù)，l為光徑長度。

F=KC

特點：選擇性好，專屬型檢測器，靈敏度比紫外檢測器高（檢測限10-10g/ml）對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；c.示差折光檢測器（differentialrefractiveindexdetector，RID）原理：可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比；

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低（10-6g）、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；d.安培檢測器

由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為1~5L）組成。如圖。原理：利用待測物流入反應(yīng)池時在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比。采用安培檢測器時，流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測具有電活性的物質(zhì)。接參比電極和對電極接色譜柱Teflon塑料塊1cm工作電極(Pt,Au,碳糊)e.電導(dǎo)檢測器

電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜的檢測。原理：根據(jù)待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)pH>7時，該檢測器不夠靈敏。電導(dǎo)檢測器不能用于梯度洗脫。f.蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）原理：通過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（氮氣）噴成霧狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測器。在檢測器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。特點：消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高，是通用型檢測器。蒸發(fā)光散射檢測器示意圖色譜數(shù)據(jù)處理HPLC通常配有記錄儀、積分儀或色譜工作站等，以完成對檢測信號的記錄、處理和控制等。第三節(jié)

高效液相色譜分析法一、液-固吸附色譜二、液-液分配色譜三、離子交換色譜四、離子色譜五、離子對色譜六、排阻色譜七、親和色譜(AC)

主要分離類型與原理一、液-固吸附色譜

固定相：硅膠、氧化鋁等;流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸;吸附系數(shù)K不僅取決于[X固相]與[X液相]的比值，還取決于溶劑分子S的吸附能力。K大，表示該溶劑分子吸附能力強，后流出色譜柱，后出峰。

K=

二、液-液分配色譜

基本原理：組分在固定相和流動相上的分配不同K是分配系數(shù)，K大，保留時間長，后流出色譜柱。

K=

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出三、離子交換色譜

固定相：陰、陽離子交換樹脂流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；反之?；驹恚弘x子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子在交換樹脂上有不同的親和力而被分離。陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

離子交換色譜的分離機(jī)理1、不足之處：忽略了在填料表面上形成復(fù)合物時溶質(zhì)被流動相中小分子飽和并不斷進(jìn)行計量置換反應(yīng)的重要因素。2、P0：流動相中溶質(zhì)的濃度Pb：填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度D0：流動相中洗脫劑的濃度Db：填料表面上洗脫劑的濃度Z：是蛋白質(zhì)在吸附過程中從填料表面上被置換的洗脫劑的數(shù)目。①Z可以小到忽略不計，反應(yīng)常數(shù)變?yōu)榉峙湎禂?shù)②在Z值不能忽略時在等度洗脫蛋白質(zhì)的過程中，容量因子K’與保留體積成比例，同時洗脫過程中，Kd，Db是常數(shù)，用Kz表示。離子交換色譜的影響因素1、填料孔徑的影響2、柱長的影響3、流速的影響4、PH值的影響四、離子色譜

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。

五、離子對色譜

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配。陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子。六、排阻色譜色譜

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小和形狀不同分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

七、親和色譜(AC)

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。載體LX配基待分離物質(zhì)親合色譜影響因素1、平衡和平衡緩沖溶液2、蛋白質(zhì)的濃度和溫度效應(yīng)3、特異性洗脫4、非特異性洗脫(受緩沖溶液中的PH值，離子強度，溫度和介電常數(shù)的控制。)影響分離的因素與操作條件的選擇(一)影響分離的因素

1、在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項B/U較小，可以忽略不計，即：H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如下圖所示。2、流速

流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。

3、固定相及分離柱氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。（二）分離類型選擇（見下頁表）分離類型選擇（choiceofseparationtypes）第四節(jié)固定相和流動相的選擇一、固定相

1、高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。

2、固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類固定相的要求：①顆粒細(xì)且均勻；②傳質(zhì)快；③機(jī)械強度高，能耐高壓；④化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。二、流動相

正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長

要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。（3）高純度由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好（5）低粘度（粘度適中）若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。

流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑有己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。

第五節(jié)圖形結(jié)果分析及其應(yīng)用色譜圖(Chromatogram):

色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號強度,橫坐標(biāo)為時間←色譜峰時間(分)基線↓峰高峰寬響應(yīng)值色譜數(shù)據(jù)處理分離柱檢測器記錄儀積分儀色譜工作站色譜儀信號輸出方框圖色譜數(shù)據(jù)處理通過ADC轉(zhuǎn)換器,把模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,然后采用色譜軟件處理給出色譜圖等信息。

數(shù)據(jù)處理原理：◆峰的檢測◆

數(shù)據(jù)采集◆基線校正和重疊峰的分離

自動處理人工修正●峰的檢測峰的檢測和判別是依據(jù)在基線的訊號水平上，預(yù)設(shè)一個“閾值”，超過該值時，判別為峰可開始檢測。一般采用下面兩種方式判別峰訊號的變化：切線色譜峰的判斷最小面積▲依照信號斜率的變化檢測信號▲依照積分面積檢測峰信號

保留時間和峰面積的計算●基線校正和重疊峰的分離在色譜分析中，經(jīng)常會遇到基線漂移和色譜峰不能完全分離的情況。通常采用谷—谷規(guī)則或預(yù)設(shè)基線漂移值參數(shù)來解決

色譜儀自動定性和定量分析

◆“時間窗”法(TimeWindow)：tR±Δt

對整個色譜圖上各個峰的保留值都設(shè)定相同區(qū)間“時間窗”，規(guī)定圖中各個峰保留時間的變化范圍。該法設(shè)置簡單，但用于識別保留時間相差很近的相鄰峰不大方便。◆“時間帶”法(TimeBand):tR(1±a%)

對每個需識別的定量峰，都設(shè)定一個保留時間的相對變動范圍。該設(shè)置較麻煩，但對不同峰可給出不同的變動范圍，對識別相鄰峰的分辨率較好，同時用于編組定量分析也很方便。高效液相色譜的定性和定量分析

1.定性分析在液相色譜中保留值定性的方法主要是用直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對照的方法。當(dāng)未知峰的保留值（tR′或VR′）與某一已知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同時，則未知峰可能與此已知標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時，未知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認(rèn)定未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)。

2.定量分析基本方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等。

外標(biāo)法———標(biāo)準(zhǔn)曲線法是一種簡便、快速的絕對定量方法（歸一化法則是相對定量方法）。首先用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。具體作法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過原點的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對校正因子。實驗儀器的基本操作1、開機(jī)，啟動裝置，進(jìn)入Win2000；開啟LC，點擊Instrumentlonline圖標(biāo)，進(jìn)入儀器控制面板，設(shè)置所需各項參數(shù)。2、設(shè)置分析用流動相清洗流路,等待色譜柱、系統(tǒng)的平衡，基線穩(wěn)定，開始進(jìn)樣分析。3、分析結(jié)束，數(shù)據(jù)處理，打印報告。4、關(guān)閉柱溫箱和檢測器，沖洗色譜柱，關(guān)閉脫氣機(jī)、泵，關(guān)閉整個裝置。