關(guān)注女性健康

制作宿舍：520女明星全裸出鏡代言粉紅絲帶2005年女明星全裸出鏡代言粉紅絲帶2006年女明星全裸出鏡代言粉紅絲帶2007年女明星全裸出鏡代言粉紅絲帶2008年女明星全裸出鏡代言粉紅絲帶2009年不容忽視的美麗女性健康第一殺手乳腺疾病性感乳房疾病的比例據(jù)統(tǒng)計，全球每年約50萬女性患上乳腺癌，女性患上乳腺疾病的幾率高達10%，特別是35—45歲的女性，更是女性的高發(fā)年齡，目前，乳腺癌已經(jīng)成為嚴重威脅我國婦女健康的第一殺手！70%的女性在25到50歲，有乳房纖維囊腫癥狀。從數(shù)字看乳腺疾病乳腺癌已發(fā)展為全球發(fā)病率排第一位的惡性腫瘤，占各種惡性腫瘤的7-10%，我國乳腺癌發(fā)病率以每年3%的速度遞增，全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌，50萬人死于乳癌。

乳腺癌已成為中國城市女性“第一殺手”，平均每十二分鐘就有一名女性死于乳腺癌，且正以每年百分之三到四的增長率急劇上升。

“林黛玉”一角的扮演者：陳曉旭終年42歲……葉凡終年37歲蔡琴汪明荃李媛媛終年41歲健康如此重要，那現(xiàn)在的檢測手段有那些呢？（一)X線檢查雙側(cè)乳腺作正側(cè)位攝片是乳腺癌常用的診斷（二)熱圖像檢查有液晶和遠紅外熱圖象（三)近紅外線掃描影像診斷組織學(xué)檢驗活體組織病理檢查簡稱活檢，方法有：細針吸取細胞學(xué)檢查、穿刺活檢、咬取活檢、切取活檢、切除活檢等。今天給大家介紹一種通過分子生物學(xué)的手段來診斷乳腺癌.原癌基因HER-2/c-erbB-2/nue與v-erbB

原癌基因有高度同源性，其具有酪氨酸激酶活性，現(xiàn)已證實在20%～30%的乳腺癌病人中HER-2基因擴增或蛋白過表達，而大量研究表明HER-2的過表達與乳腺癌病程的進展及不良預(yù)后有關(guān)隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，目前對HER-2基因的研究已越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，同時乳腺癌的治療策略也發(fā)生了極大的變化，通過抑制細胞活化信號的傳遞來治療有HER-2基因擴增的乳腺癌的藥物赫塞汀(Herceptin)已通過美國FDA認證，并已成功應(yīng)用于臨床治療，療效顯著。以往多采用免疫組化(IHC)方法檢測HER-2蛋白的表達，熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是近年來對HER-2基因檢測的一種新方法，運用這兩種檢測技術(shù)對乳腺癌標本的HER-2蛋白和基因進行檢測，通過兩者綜合的結(jié)果判定.原癌基因HER-2/neu的研究是當前熱點之一。

Her-2基因是定位于染色體17q12-21的人類表皮生長因子受體2基因，編碼具有細胞內(nèi)跨膜酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白P185。在人類乳腺癌中過表達率為10%～34%,其過表達與腫瘤細胞的耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后有關(guān)。該受體蛋白通過同源二聚體或異源二聚體的方式偶聯(lián)，使得該信號傳導(dǎo)通路被明顯激活，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Her-2基因的過表達還是一個重要的臨床預(yù)后指標，具有Her-2基因過表達的患者總生存期（OS）和無病生存期（DFS）較短。采用熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)的方法檢測乳腺癌細胞內(nèi)HER22/neu的過表達,旨在探討癌基因與臨床病理狀態(tài)的關(guān)系?；驹頍晒庠浑s交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合，其基礎(chǔ)是Southernblot原理，它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過熒光標記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。

免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。

眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體(第一抗體)作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶(常用辣根過氧化物酶)或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒)。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進行檢測。

1）特異性強。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時，才會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2）敏感性高。在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP三步法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。3）定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合。該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對病理學(xué)領(lǐng)域開展深入研究是十分有意義的。特點

目前國際公認的用于檢測Her-2的方法有兩種：一是免疫組化法（IHC），二是熒光原位雜交技術(shù)（FISH）。免疫組化法是目前臨床上常用的檢測Her-2受體蛋白表達的方法，它針對Her-2的特異性抗體來檢測細胞表面Her-2的表達情況。FISH用于檢查17號染色體著絲粒和Her-2基因擴增情況。不少研究結(jié)果認為FISH的敏感性和特異性較高，應(yīng)作為一線檢測方法。然而，IHC操作簡便、費用低廉，適于初篩，但多數(shù)IHC檢測方法并未最佳化，而且蛋白表達與基因擴增兩者本應(yīng)具有一致性。材料標本來源選取乳腺癌手術(shù)切除標本，所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。1.方法

免疫組化法（IHC）常規(guī)切片脫蠟后入PBS液，組織片入EDTApH8.

0枸櫞(jǔ

yuán)酸(檸檬酸)緩沖液中行高壓修復(fù)，切片浸入3%H2O210min。PBS液充分洗滌后滴加一抗于切片上，37℃烤箱孵育90min，PBS液洗5min×3次，二抗室溫孵育30min;PBS

充分洗滌后DAB染色，顯微鏡下觀察顯色，達到信號強度后終止顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片?？乖迯?fù)(Antigenretrieval，AR)技術(shù)，是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(xué)（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，通過機械的方法斷開因福爾馬林固定的導(dǎo)致的抗原表位和不相關(guān)蛋白間的交聯(lián)鍵，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)，使抗體更好的滲透，與表位結(jié)合?？乖迯?fù)能最大程度地恢復(fù)在制片等過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結(jié)果，成為一種有效的補救措施，AR-IHC已廣泛應(yīng)用于臨床的研究中。為什么要進行抗原修復(fù)？

(1)福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。

(2)甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應(yīng)。

為什么要抗原修復(fù)呀？高壓修復(fù)操作步驟：①常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M檸檬酸鹽緩沖液pH6.0（800～1000ml）于壓力鍋中，加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計時1－2分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫（稍冷后，可在自來水龍頭下加速冷卻），取出切片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS（pH7.2－7.4）沖洗兩次，每次3分鐘。進行組化的下一步。（3）注意事項：①加熱時間長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源總時間控制在5－8分鐘為好，時間長可能會使染色背景加深。②必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH值增高導(dǎo)致組織脫片。③高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷卻后，才能把切片取出。④為防止組織脫片，玻片必須經(jīng)清潔處理后，包被0.01％多聚賴氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxysilane)。⑤緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丟失）。用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。

PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時間的選擇？（1）單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內(nèi)洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導(dǎo)致切片的脫落。（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。DAB顯色時間如何把握？（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短；另一方面就是封閉時間過長。復(fù)染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）。

封片：封片：為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）組織切片，65℃過夜烘烤，二甲苯室溫脫蠟2次，每次10min，隨后浸入100%乙醇中5min，復(fù)水后50℃下30%酸性亞硫酸鈉處理20~30min，2×SSC漂洗2次，每次5min，浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育7~8min，2×SSC溶液漂洗后一次經(jīng)-20℃預(yù)冷的70%、85%、100%乙醇各2min脫水，丙酮浸泡2min，干燥，加蓋玻片至78·56℃3min；將玻片在變性液中浸泡5min，預(yù)冷的70%、85%、100%乙醇中各3min梯度脫水，45℃~50℃預(yù)熱2~5min后與探針在42℃保溫箱中過夜雜交；玻片用甲酰胺洗滌，暗處自然干燥后經(jīng)二脒基苯基吲哚熒光染料（DAPI）復(fù)染，暗處放置20～30min后熒光顯微鏡下選用合適的濾波片觀察玻片。實驗流程

2.結(jié)果判定熒光原位雜交結(jié)果:計數(shù)30個細胞核內(nèi)橘紅色的HER22/neu基因熒光信號和17號染色體的綠色熒光信號,統(tǒng)計其比例(比例30個細胞核中紅信號總數(shù)/30個細胞核中綠信號總數(shù))。<1.8為陰性結(jié)果,>2.2為陽性結(jié)果,提示樣本中HER22/neu基因擴增。若比例在1.8～2.2之間,則增加計數(shù)細胞100個或重作計數(shù)。免疫組化結(jié)果:以細胞膜棕黃色染色為陽性判斷標準,染色被分為0～3+(4級)。腫瘤細胞無染色為0,細胞膜弱染色或非連續(xù)性染色、未環(huán)繞整個細胞膜為1+,細胞膜中等程度連續(xù)性染色為2+,強染色為3+。圖1免疫組化法陰性Fig1ThenegativeresultsofIHC全部瘤細胞中細胞膜無染色或少于10%的腫瘤細胞膜染色(－)圖2免疫組化法+Fig2TheweakpositiveresultsofIHC大于10%的瘤細胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細胞膜著(+)圖3免疫組化法++Fig3ThemoderatepositiveresultsofIHC瘤細胞細胞膜呈現(xiàn)大于10%輕度至中度完整染色結(jié)果為(++)圖4免疫組化法+++Fig4ThestrongpositiveresultsofIHC瘤細胞細胞膜大于10%完全強染色結(jié)果為(+++)提示該樣本無Her-2基因擴增（圖5）提示樣本中Her-2基因擴增（圖6）Her2探針：紅色熒光對照探針：綠色熒光圖1

FISH法檢測HER22/neu基因(+)Fig.1

HER22/neu(+)byFISH圖2

FISH法檢測HER22/neu基因(-)Fig.2

HER22/neu(-)byFISH表118例29～50歲年齡組乳腺癌患者C-erbB2蛋白表達水平和Her-2基因擴增情況

Tab2TheexpressionlevelofC-erbB2proteinandtheamplificationofHer-2genein118breastcancerpatientsaging29~50IHC檢測結(jié)果－++++++合計FISH-44（89.8%）30（75.0%）4（28.6%）2（13.3%）80FISH+5（10.2%）10（25.0%）10（71.4%）13（86.7%）38合計494014151183討論國外資料顯示，在乳癌患者中，大約有25%~30%的患者會有Her-2蛋白的高表達，而這其中90%~95%的蛋白高表達是由于Her-2/neu基因擴增引起的。在藥物的臨床應(yīng)用過程中，對Her-2表達的檢測是至關(guān)重要的。原癌基因HER22/neu位于17號染色體q2l,其狀態(tài)在各期乳腺癌中長時間保持穩(wěn)定,過表達激活后,可加快細胞增生、縮短細胞周期、增強惡性表現(xiàn)并出現(xiàn)抗凋亡及對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象

。乳腺癌患者中Her22/neu過表達約15%～30%,過表達者化療、激素治療效果及預(yù)后均相對較差。抗HER22單克隆抗體“Herceptin”(赫賽汀)能抑制HER22過表達的乳腺癌細胞,是第一個基因靶向治療乳腺癌的藥物,在美國現(xiàn)已批準臨床使用,但要求必須用FISH技術(shù)檢測出HER22基因擴增才可使用,HER22的檢測已進入基因時代。HER22/neu陽性者細胞間的黏著力較小,使腫瘤細胞更易擴散轉(zhuǎn)移。免疫組化法（IHC）是目前臨床上常用的檢測Her-2受體蛋白表達的方法。它是針對Her-2的特異性抗體來檢測細胞表面Her-2的表達情況，該方法簡便、價廉、可重復(fù)性好、對材料的要求不高，在臨床上廣泛應(yīng)用。但IHC檢測對象是Her-2受體蛋白，在標本固定和處理中可能會使蛋白質(zhì)變性破壞而影響檢測結(jié)果，還有17號染色體的非整倍體現(xiàn)象會使檢測出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，加上結(jié)果主觀判讀的誤差等，可直接影響結(jié)果的可靠性。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是用于檢查17號染色體著絲粒和Her-2/neu基因擴增情況的乳腺癌診斷新技術(shù)，染色體的穩(wěn)定性比蛋白質(zhì)好得多，所以FISH技術(shù)在實驗過程中受到的影響較小。加之FISH技術(shù)可以定量判讀結(jié)果，所以此技術(shù)敏感性和特異性高、簡便快速，可以分析基因缺失、擴增和重排，還可以避免17號染色體的非整倍體現(xiàn)象使結(jié)果假陽性，已被公認為檢測Her-2基因過表達的金標準。在進行FISH時也會受到一些因素的影響，比如蛋白消化不當、烤片溫度過高等，可使熒光信號減弱或無信號等。為確保消化充分，我們在實驗中自然干