見血封喉種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018見血封喉種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了見血封喉（AntiaristoxicariaLesch.）種子超低溫保存過(guò)程中的術(shù)語(yǔ)和定義、保存種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于見血封喉種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。見血封喉AntiaristoxicariaLesch.為?？疲∕oraceae）見血封喉屬（AntiarisLesch.）常綠喬木，又名箭毒木。樹皮灰色，具有乳白色液汁，是一種劇毒植物和藥用植物，同時(shí)也是國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物。其鮮樹汁和種子入藥，鮮樹汁有強(qiáng)心、催吐、瀉下、麻醉之功效；種子有解熱功效。收載于《中華本草（1999）》。見血封喉果實(shí)AntiaristoxicariaLesch.fruits見血封喉其核果梨形、肉質(zhì)，具宿存苞片，成熟的核果，直徑2cm，鮮紅至紫紅色。見血封喉種子AntiaristoxicariaLesch.seeds見血封喉的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子灰白色，近卵形，背面凸，腹部平。種子無(wú)胚乳，外種皮堅(jiān)硬，胚根小。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過(guò)前處理的見血封喉種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實(shí)采收5月至6月，待果實(shí)的表皮變紅至紫黑色，大量果實(shí)脫落掉地時(shí)，即可采收。結(jié)果的見血封喉樹齡大都在100年，樹干高大，上樹采集果實(shí)較難，因此需脫落時(shí)在地上收集。將果肉去除干凈，取出種子清洗干凈。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于10℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過(guò)2個(gè)月）。種子前處理生活力檢測(cè)參照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法檢測(cè)種子生活力。隨機(jī)抽取30粒種子，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，沿種脊小心將種子分成2爿后放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC溶液浸沒種子，室溫（25℃）避光放置4h后觀察染色結(jié)果。生活力計(jì)算直接用肉眼對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無(wú)生活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的見血封喉種子生活力應(yīng)≥60%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹見血封喉種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為1500:1，室溫條件下干燥處理20~40h，在干燥過(guò)程中定期測(cè)定種子含水量，將種子含水量由45%~55%降至20%~30%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測(cè)定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量見血封喉種子保存量不少于360粒，以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式見血封喉種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法，即將裝有種子的15mL凍存管（每管15粒種子）置于裝載液（LS）中并于25℃處理種子20min，再用玻璃化保護(hù)溶液（PVS2）冰浴處理種子30min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出2個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍3min，而后用洗滌液（DS）浸泡15min，并用純凈水洗滌3次。凍后種子生活力檢測(cè)取出1管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測(cè)方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力≥60%時(shí)視為保存成功?；謴?fù)培養(yǎng)將剩下1管解凍后的見血封喉種子，播種到帶有無(wú)菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度25℃～30℃，濕度70%～85%條件下培養(yǎng)。見血封喉種子出芽周期大概25～40d。附錄[1]TTC的配制和保存方法精密稱取TTC1.00g，溶于100mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6.5~7.5，置棕色瓶?jī)?nèi)4℃冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氫鉀溶于1L無(wú)菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氫鈉溶于1L無(wú)菌水中；I:II=2:3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液）[2]裝載液（LS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖13.7g，稱量甘油11.9mL，溶于液體MS培養(yǎng)基中，調(diào)pH至5.8，并定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。[3]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。注意：配置時(shí)需戴手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。[4]洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。參考文獻(xiàn)中國(guó)植物志委員會(huì).《中國(guó)植物志》第23（1）卷[M].科學(xué)出版社.1998：064[2]ZhouZhekun，MichaelG.Gilbert.Moraceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2003.5:21-73.[3]國(guó)家中藥管理局編委會(huì).中華本草（第二冊(cè)）[M].XX科學(xué)技術(shù)出版社，1999：464[4]傅家瑞，宋松泉.頑拗性種子生物學(xué)[M].中國(guó)科學(xué)文化出版社，2004:1[5