陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究

陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究

【關(guān)鍵詞】

陽(yáng)離子

【摘要】目的觀測(cè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞的影響，探索其應(yīng)用于人角膜基質(zhì)細(xì)胞的可行性及安全濃度范圍，為人角膜基質(zhì)細(xì)胞的基因治療研究奠定基礎(chǔ)。方法體外培養(yǎng)人角膜基質(zhì)細(xì)胞，取第3～5代細(xì)胞鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。采用四氮唑鹽代謝法（MTT），檢測(cè)不同濃度和作用時(shí)間LipofectamineTM2000對(duì)培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響;采用0.5%臺(tái)盼蘭染色法，檢測(cè)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對(duì)培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞存活率的影響與其濃度和作用時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（LF2000）對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞的影響與濃度和作用時(shí)間有關(guān)。LF2000在濃度高于一定水平時(shí)可以引起細(xì)胞增殖和存活率的下降，濃度相同時(shí)作用時(shí)間越長(zhǎng)下降越明顯。LF2000在濃度40μg/ml以下作用24h不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖和存活率產(chǎn)生影響。結(jié)論LipofectamineTM2000在一定濃度范圍內(nèi)不引起細(xì)胞毒性。LipofectamineTM2000有望在人角膜基質(zhì)細(xì)胞的基因治療中發(fā)揮重要作用。關(guān)鍵詞角膜基質(zhì)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)離子脂質(zhì)體

角膜基質(zhì)層占全角膜厚度的90%以上，角膜損傷后修復(fù)過(guò)程中基質(zhì)細(xì)胞的變化，對(duì)視功能的恢復(fù)極為重要。臨床醫(yī)生一直在努力尋找調(diào)節(jié)角膜損傷愈合反應(yīng)的藥物，分子和細(xì)胞水平藥物治療是目前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)利用不同濃度和作用時(shí)間陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000作用于體外培養(yǎng)人的角膜基質(zhì)細(xì)胞，探索其濃度范圍及作用時(shí)間，旨在為基因預(yù)防及治療角膜疾病打下基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料主要儀器:低溫離心機(jī)，恒溫箱，細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，低速恒溫離心機(jī)（Hereus公司）。主要試劑:脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Gibco/BRL公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco/BRL公司）。1.2方法1.2.1人眼角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法，將組織碎塊接種于培養(yǎng)瓶壁上，先置入37℃、5%CO2溫箱中4h，待組織塊貼壁微干涸后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基適量。培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)3～5天換1次培養(yǎng)液。原代基質(zhì)細(xì)胞80%匯合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下，先吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，用少量D-Hanks漂洗1次。加入0.25%胰蛋白酶少許，置溫箱中3min。在倒置相差顯微鏡下見細(xì)胞胞質(zhì)回縮成圓形，彼此分離并即將離壁，加入20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液終止消失。再加入適量培養(yǎng)基，用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打，使細(xì)胞脫離瓶壁，成為細(xì)胞懸液。按1:2分裝細(xì)胞懸液后置溫箱中培養(yǎng)，每3天換1次培養(yǎng)液。1.2.2細(xì)胞爬片的制備及鑒定超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下，將已消毒的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，每孔2片。將第三代融合生長(zhǎng)的基質(zhì)細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液。將消化稀釋的細(xì)胞懸液滴在蓋玻片上，置入溫箱中培養(yǎng)，常規(guī)定時(shí)換液;細(xì)胞生長(zhǎng)至接近融合后，取出蓋玻片，D-Hanks液漂洗后，置入固定液中固定。用第3～5代的人眼角膜基質(zhì)細(xì)胞作成細(xì)胞爬片，至50%～60%匯合后取出。D-Hanks液沖洗2次后，置于4℃冷丙酮液中固定15min，D-Hanks沖洗后空氣中自然干燥，置-20℃?zhèn)溆?。PBS液洗5min×3次，Tritonx-100洗滌5min，再用PBS洗5min×3次。加0.3%H2O2/甲醇溶液于玻片上，置濕盒內(nèi)室溫下處理20min，PBS洗5min×3次。加正常血清于玻片上，置濕盒內(nèi)室溫下20min。小鼠抗人波形蛋白及角蛋白單克隆抗體工作液于玻片上，置濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，PBS洗5min×3次。加生物素化羊抗鼠二抗于玻片上。置濕盒內(nèi)37℃30min，PBS洗5min×3次。加入HRP（辣根素過(guò)氧化物）酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，置濕盒內(nèi)37℃30min，PBS洗5min×3次。AB/H2O2顯色，流水充分洗。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。1.2.3LipofectamineTM2000對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞的影響MTT測(cè)定法觀察LipofectamineTM2000對(duì)基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響:取第四代基質(zhì)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度4×104/ml接種到96孔板內(nèi)，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，各組分別加入濃度為0（陰性對(duì)照）、5、10、20、40、80μg/ml的LipofectamineTM2000，每孔100μl，繼續(xù)置溫箱培養(yǎng)。每組設(shè)復(fù)孔5孔，另設(shè)5孔空白對(duì)照。培養(yǎng)12h或24h后每孔加入5mg/mlMTT10μl，繼續(xù)置入溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4h后，吸走原液，每孔加入DMSO100μl，室溫靜置5min，搖勻后于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔550nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A值）。計(jì)算公式為:增殖率=（LipofectamineTM2000組A值/陰性對(duì)照組A值）×100%。臺(tái)盼蘭染色觀察LipofectamineTM2000對(duì)基質(zhì)細(xì)胞存活的影響:細(xì)胞接種、分組方法同MTT法。分別在加入LipoˉfectamineTM2000后12h及24h，每組取5孔，小心吸棄培養(yǎng)上清液，滴加一滴0.4%臺(tái)盼蘭溶液，立即在倒置相差顯微鏡下觀察。死亡細(xì)胞因細(xì)胞膜完整性破壞，可被臺(tái)盼蘭染成蘭色，而正常細(xì)胞染色陰性。分鐘內(nèi)分別計(jì)數(shù)每孔5個(gè)低倍視野中染色陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的數(shù)目，取平均值作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。細(xì)胞存活率計(jì)算公式:存活率=（臺(tái)盼蘭染色陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS軟件包，采用t檢驗(yàn)及方差分析進(jìn)行均數(shù)間差異顯著性比較。2結(jié)果2.1人角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定組織塊接種后第3天，細(xì)胞從組織塊邊緣游離出來(lái)，單層，貼壁，細(xì)胞呈梭性，核圓，居中，細(xì)胞傳代后，7天后細(xì)胞基本融合生長(zhǎng)。細(xì)胞爬片行免疫組織化學(xué)染色后，在顯微鏡下可見細(xì)胞胞漿中均呈灰褐色陽(yáng)性染色，即波形蛋白染色陽(yáng)性，而角蛋白染色為陰性，證明所培養(yǎng)細(xì)胞確實(shí)為角膜基質(zhì)細(xì)胞。2.2LipofectamineTM2000對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞的影響2.2.1LipofectamineTM2000對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和存活率的影響（1）LipofectamineTM2000在濃度20μg/ml下作用24h，對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和存活率沒有明顯影響，與陰性對(duì)照組均數(shù)比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）;在濃度40μg/ml以上作用24h，則引起細(xì)胞增殖和存活率的明顯降低（P<0.05）。（2）LipofectamineTM2000在濃度40μg/ml或80μg/ml下作用24h比作用12h組細(xì)胞增殖和存活率高，差異有顯著性（P<0.05）。（3）從表1、2，可以看出人角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖率和存活率隨LipofectamineTM2000濃度的增高而呈下降的趨勢(shì)。表1不同濃度LF2000對(duì)培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞增殖率的影響（略）表2不同濃度LF2000對(duì)培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞存活率的影響（略）3討論正常角膜基質(zhì)由250層膠原纖維板構(gòu)成，呈交錯(cuò)排列，每層纖維板又由許多平行排列、直徑相同的膠原纖維組成。基質(zhì)區(qū)的主要細(xì)胞成分為角膜基質(zhì)細(xì)胞，它合成和分泌纖維，并且對(duì)其排列和平衡都起作用。角膜創(chuàng)傷和修復(fù)過(guò)程中基質(zhì)細(xì)胞的變化，對(duì)角膜的結(jié)構(gòu)和功能有重要的影響。近年來(lái)，人們?cè)谘芯亢涂刂平悄?chuàng)傷修復(fù)過(guò)程方面進(jìn)行了相當(dāng)大的努力，但是許多修復(fù)過(guò)程機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，基因治療作為一種全新的治療手段已日益受到重視?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)作為基因治療的基礎(chǔ)，在眼科疾病的診斷和治療的研究中也有廣泛的應(yīng)用前景［1～3］。其關(guān)鍵技術(shù)在于能使外源基因進(jìn)入靶細(xì)胞的載體，一個(gè)理想的載體應(yīng)具有能在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下將目的基因轉(zhuǎn)向特定的靶細(xì)胞或靶組織、不激發(fā)炎癥反應(yīng)或免疫反應(yīng)、能夠根據(jù)不同治療需求短暫或長(zhǎng)期在宿主體內(nèi)表達(dá)、載體應(yīng)易于構(gòu)建和純化、高滴度且不會(huì)引起插入突變或引發(fā)野生型病毒污染［4，5］。為基因治療的載體通常包括有裸體DNA（也稱質(zhì)粒）、陽(yáng)離子脂質(zhì)體及病毒類等［6，7］。裸體DNA轉(zhuǎn)染效率低，作為生物學(xué)方法有病毒載體介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效率雖然較高，但由于病毒載體有免疫原性，運(yùn)用于臨床治療有很大的風(fēng)險(xiǎn)性。脂質(zhì)體屬于非生物學(xué)方法沒有類似病毒載體的安全性問(wèn)題，方法簡(jiǎn)單、免疫原性弱、容量大，比較適用于體內(nèi)基因治療的途徑，尤其是目前發(fā)現(xiàn)的多價(jià)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較高［8，9］。從本實(shí)驗(yàn)可由脂質(zhì)體LipofectamineTM2000在一定濃度范圍及作用時(shí)間內(nèi)，對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和存活率沒有明顯影響，可以利用其將某些目的基因轉(zhuǎn)入角膜基質(zhì)細(xì)胞，從分子水平干預(yù)損傷后角膜修復(fù)過(guò)程，為治療角膜疾病提供一種新的更為有效的方法。

參考文獻(xiàn)1CrystalRG.Transferofgenestohumans:earlylessonsandobstaclestosuccess.Science，1995，270（5235）:404-410.2SinghVK，TripathiP.Gene