分子生物學(xué)技術(shù)-第四章 核酸分子雜交技術(shù)

1核酸分子雜交技術(shù)

NucleicacidHybridization

分子生物學(xué)技術(shù)?第四章2主要內(nèi)容第一節(jié)核酸雜交的基本原理第二節(jié)核酸探針第三節(jié)核酸分子雜交的影響因子第四節(jié)核酸分子雜交的類型3第一節(jié)核酸雜交的基本原理一、核酸變性二、核酸復(fù)性4第一節(jié)核酸雜交的基本原理

核酸的結(jié)構(gòu)

一級(jí)結(jié)構(gòu)：核苷酸的排列循序穩(wěn)定鍵：磷酸二酯鍵二級(jí)結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定鍵：氫鍵、堿基堆積力、疏水作用高級(jí)結(jié)構(gòu)：染色體5CGA一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)6第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性

變性（denaturation）:指維系核酸雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂變成單鏈的過(guò)程，并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。?；瘜W(xué)鍵變化：維持雙螺旋穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵發(fā)生斷裂，斷裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化：DNA變性改變了其空間結(jié)構(gòu)，不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變78加熱極端的pH有機(jī)試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）DNA的變性因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性9變性DNA的性質(zhì)：變性能導(dǎo)致DNA的一些理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性溶液粘度降低DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結(jié)構(gòu)，變性后代之以“柔軟”無(wú)規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度明顯下降溶液旋光性發(fā)生改變變性后DNA分子的對(duì)稱性及局部構(gòu)型改變紫外吸收增加DNA變性后，DNA溶液的紫外吸收增強(qiáng)雙鏈DNA＜單鏈DNA＜單核苷酸10第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性解鏈曲線通常利用DNA變性后在波長(zhǎng)260nm處吸光度（A260）的增加來(lái)監(jiān)測(cè)DNA變性的過(guò)程。如果以溫度對(duì)A260的關(guān)系作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。典型DNA變性曲線呈S型11融解溫度（meltingtemperature,Tm）：DNA變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過(guò)程中DNA變性一半所需要的溫度稱為融解溫度DNA的Tm值一般在82℃~95℃之間。

第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性融解溫度（Tm）特點(diǎn)：爆發(fā)式：熱變性是在變性溫度范圍內(nèi)突發(fā)的躍變過(guò)程，很像結(jié)晶達(dá)到熔點(diǎn)時(shí)的融化現(xiàn)象，故名融解溫度狹窄性：變性溫度范圍很小12Tm的影響因素：

1．DNA分子大小、均一性

2.堿基的組成

3．溶液的離子強(qiáng)度

4．pH值

5．變性劑

DNA復(fù)雜度對(duì)Tm的影響第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性13DNA的均一性有二種含義DNA分子中堿基組成的均一性：如人工合成的只含有一種堿基對(duì)的多核苷酸片段，與天然DNA比較，其Tm值范圍就較窄。因前者變性時(shí)氫鍵斷裂幾乎可“齊同”進(jìn)行①（AAA）n②（AT）n③（ATC）n

④（ATCG）n⑤（ATCGA）n待測(cè)DNA樣品組成的均一性：如樣品中只含有一種病毒DNA，其Tm值范圍較窄，若混有其它來(lái)源的DNA，則Tm值范圍較寬第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性14DNA的（G+C）含量在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的（G+C）的含量（G+C）含量越高，G-C堿基對(duì)越多，Tm值越高。因G-C堿基對(duì)具有3對(duì)氫鍵，而A-T堿基對(duì)只有2對(duì)氫鍵，DNA中（G+C）含量高顯然更能增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量。

第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性15融解溫度的影響因素：

溶液的離子強(qiáng)度溶液中離子與DNA分子中磷酸基團(tuán)形成離子鍵，需要較高溫度才能使DNA變性離子強(qiáng)度較低時(shí)，Tm值較低，而且解鏈的溫度范圍也較寬第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性16融解溫度的影響因素：

pH值pH值影響氫鍵的形成pH值在5-9范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。當(dāng)溶液pH值小于3時(shí)或大于11時(shí)，均不利于氫鍵的形成，DNA容易變性第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性17融解溫度的影響因素：

變性劑干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值常用的變性劑有甲酰胺、尿素、甲醛等

第一節(jié)核酸雜交的基本原理

一、核酸變性18雜交雙鏈（hybridduplex）DNA-DNADNA-RNARNA-RNA第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性復(fù)性（renaturation）：當(dāng)變性條件緩慢去除后，兩條彼此分開的互補(bǔ)單鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程，是變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱之為“退火”19

復(fù)性影響因素：

DNA的復(fù)性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性溫度和時(shí)間DNA濃度DNA分子大小和復(fù)雜度離子強(qiáng)度20復(fù)性影響因素：

1.溫度和時(shí)間一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢復(fù)性時(shí)溫度下降必須是一緩慢過(guò)程，若在超過(guò)Tm的溫度下迅速冷卻至低溫（如4℃以下），復(fù)性幾乎是不可能的第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性21復(fù)性影響因素：

2.DNA濃度

DNA復(fù)性的第一步是兩個(gè)單鏈分子間的相互作用“成核”“成核”速度與DNA濃度的平方成正比溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合“成核”的機(jī)會(huì)越大第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性22復(fù)性影響因素：

3.DNA分子大小和復(fù)雜度用非重復(fù)堿基對(duì)（bp）數(shù)表示核酸分子的復(fù)雜性。多聚（A）的復(fù)雜性為1，重復(fù)的（ATGC）n組成的多聚體的復(fù)雜性為4，分子長(zhǎng)度是105核苷酸的非重復(fù)DNA序列的復(fù)雜性為105原核生物基因組均為非重復(fù)順序，故以非重復(fù)核苷酸對(duì)表示的復(fù)雜性直接與基因組大小成正比真核生物基因組中的非重復(fù)片段也是如此第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性23DNA順序的復(fù)雜性對(duì)復(fù)性的影響簡(jiǎn)單順序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）這二種單鏈序列復(fù)性時(shí)，互補(bǔ)堿基的配對(duì)較易實(shí)現(xiàn)順序復(fù)雜的DNA，如小牛DNA的非重復(fù)部分（一般以單拷貝存在于基因組中），這種復(fù)雜的特定序列要實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，顯然要比上述簡(jiǎn)單序列困難得多第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性24復(fù)性影響因素：

4.離子強(qiáng)度對(duì)復(fù)性的影響增加鹽濃度可增進(jìn)互補(bǔ)鏈合成雙鏈的速度，鹽中和DNA單鏈中磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，減少互補(bǔ)鏈靜電排斥第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性25Cot值

在核酸復(fù)性研究中，定義了一個(gè)Cot的術(shù)語(yǔ)，與DNA復(fù)雜度之間的關(guān)系。Co為單鏈DNA的起始濃度t是以秒為單位的時(shí)間復(fù)性速度一般可以用Cot1/2來(lái)衡量，Cot1/2表示單鏈DNA的起始濃度與復(fù)性一半所需時(shí)間之積（mol.s/L），與復(fù)性速率成反比，Cot1/2增大意味著反應(yīng)速度變慢。第一節(jié)核酸雜交的基本原理

二、核酸復(fù)性26第一節(jié)核酸雜交的基本原理

三、核酸分子雜交基本原理核酸雜交示意圖

利用核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。分子雜交可以發(fā)生在同源或異源的DNA鏈與DNA鏈之間，也可在RNA鏈與DNA鏈之間形成。

27雜交的本質(zhì)：就是在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性分子雜交技術(shù)：利用探針（probe）與靶DNA（RNA）雜交，特異性識(shí)別靶DNA（RNA）第一節(jié)核酸雜交的基本原理

三、核酸分子雜交基本原理28第二節(jié)核酸探針一、核酸探針的種類二、核酸探針的標(biāo)記三、核酸探針的純化四、核酸探針的檢測(cè)29第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類核酸探針（nucleicacidprobe)：是特定核苷酸序列（單鏈，被標(biāo)記）與特定靶基因序列發(fā)生特異性互補(bǔ)（可雜交）雜交后可用特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記的核酸分子30高度特異性靈敏度高易于標(biāo)記和檢測(cè)且穩(wěn)定制備方便第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類確定特定核苷酸序列（與靶序列互補(bǔ)）標(biāo)記（檢測(cè)方法）選擇探針的最基本的要求31第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類核酸探針的類型基因組DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針32來(lái)源：這類探針來(lái)源于某種生物的基因組，多為某一基因的全部或部分序列制備方法:基因克隆的方法聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)特點(diǎn):克隆在載體中的DNA片段，可無(wú)限繁殖，取之不盡PCR制備探針簡(jiǎn)便和省時(shí)相對(duì)RNA而言，DNA探針不易降解，標(biāo)記方法也較成熟第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的設(shè)計(jì)-基因組DNA探針33cDNA（complementaryDNA）：是指與mRNA互補(bǔ)的DNA分子特點(diǎn):不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達(dá)的研究排除了RNA酶的影響，現(xiàn)已成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)實(shí)驗(yàn)第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類-cDNA探針34RNA探針與靶序列的雜交效率較高，穩(wěn)定性也高RNA分子大多以單鏈形式存在，幾乎不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RNA分子中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交少，雜交后未雜交的探針?lè)肿铀饪捎肦NA酶去除，本底的干擾低。RNA探針有易降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。

第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類-RNA探針35

特點(diǎn):探針長(zhǎng)度較短（一般為10～50bp）人工合成（避免天然探針的缺點(diǎn)）尤其適合點(diǎn)突變的檢測(cè)由于探針的長(zhǎng)度較短，特異性較低，雜交信號(hào)較弱，但經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)仍可設(shè)計(jì)出非常特異的寡核苷酸探針

第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類-寡核苷酸探針36寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則探針長(zhǎng)度：一般要求在20～50bpG／C含量為40％～60％探針?lè)肿又袘?yīng)避免互補(bǔ)序列避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個(gè)，如GGGG-或-CCCC-

借助計(jì)算機(jī)相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較

第二節(jié)核酸探針

一、核酸探針的種類37理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)特異：靶序列特異穩(wěn)定：標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值靈敏：標(biāo)記物被檢測(cè)無(wú)毒：標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無(wú)損傷簡(jiǎn)便：操作簡(jiǎn)單便易：價(jià)格低廉第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標(biāo)記381.缺口平移法（雙鏈）2．隨機(jī)引物法（單鏈）第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標(biāo)記-放射性同位素標(biāo)記

393．DNA探針的末端標(biāo)記

（1）Klenow大片段的末端標(biāo)記法

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標(biāo)記-放射性同位素標(biāo)記

40（2）T4噬菌體多核苷酸激酶標(biāo)記法（polynucleotidekinase，PNK)，也稱5'-末端標(biāo)記法

多用于寡核苷酸探針的標(biāo)記3．DNA探針的末端標(biāo)記

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標(biāo)記-放射性同位素標(biāo)記

41

1．生物素標(biāo)記核酸探針生物素-UTP的結(jié)構(gòu)示意圖

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標(biāo)記-非放射性同位素標(biāo)記

422．光敏生物素標(biāo)記核酸探針

光敏生物素結(jié)構(gòu)圖

第二節(jié)核酸探針

二、核酸探針的標(biāo)記-非放射性同位素標(biāo)記

3．地高辛標(biāo)記核酸探針

4．酶標(biāo)記核酸探針

5．熒光素標(biāo)記核酸探針

43第二節(jié)核酸探針

三、標(biāo)記探針的純化探針制備和標(biāo)記時(shí)加入的dNTP是過(guò)量，除去游離標(biāo)記物及其dNTP凝膠過(guò)濾層析法利用凝膠的分子篩作用乙醇沉淀法沉淀探針DNA44第二節(jié)核酸探針

四、探針的檢測(cè)-放射性同位素探針的檢測(cè)

1.放射自顯影將雜交膜與X膠片在暗盒中曝光一定時(shí)間2.γ計(jì)數(shù)器

雜交膜剪成小塊，真空干燥后轉(zhuǎn)入閃爍瓶，加入閃爍液，在液閃儀上自動(dòng)計(jì)數(shù)45

1．偶聯(lián)反應(yīng)

2．顯色反應(yīng)

(1)酶促顯色法

(2)熒光法

(3)化學(xué)發(fā)光法

第二節(jié)核酸探針

四、探針的檢測(cè)-非放射性的探針的檢測(cè)

46標(biāo)記物性質(zhì)標(biāo)記分子標(biāo)記方法檢測(cè)方法放射性分子

[α32P]dNTPNT、PCR、RP放射自顯影或計(jì)數(shù)[γ32P]dNTPTL放射自顯影或計(jì)數(shù)35SNT放射自顯影或計(jì)數(shù)非放射性分子生物素Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶標(biāo)親和素或酶標(biāo)光敏生物素600W可見(jiàn)光照抗生物素抗體顯色生物素化補(bǔ)骨脂素365紫外線照抗生物素抗體顯色酶過(guò)氧化物酶化學(xué)合成法或直接法直接底物顯色或用酶抗體+底物顯色堿性磷酸酶化學(xué)合成法或直接法直接底物顯色或用酶抗體+底物顯色熒光素羅丹明和FITC合成法熒光顯微鏡觀察或酶標(biāo)抗體+底物顯色半抗原地高辛RP、NT酶標(biāo)抗體+底物顯色常用核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)第二節(jié)核酸探針

47第二節(jié)核酸探針

四、探針的檢測(cè)

48第三節(jié)核酸分子雜交類型一、Southern印跡雜交二、Northern印跡雜交三、菌落雜交 四、斑點(diǎn)雜交 五、原位雜交六、熒光原位雜交七、微板酶聯(lián)雜交

49

固相雜交探針被測(cè)DNA（RNA）在固體支持物上雜交容易洗膜液相雜交探針被測(cè)DNA（RNA）在液體中雜交靈敏度高按照雜交的反應(yīng)條件分為固相和液相雜交兩類：第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

雜交分類正向雜交（靶序列固定）反向雜交（探針固定）50分子雜交技術(shù)一般過(guò)程☆探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素）☆待測(cè)核酸樣品制備（分離，純化）☆雜交（液相，固相，原位雜交）☆雜交后處理（去掉非特異雜交分子）☆顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）☆結(jié)果分析第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

51核酸分子雜交技術(shù)類型

雜交類型檢測(cè)目的及范圍Southern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子菌落雜交檢測(cè)固定在膜上,經(jīng)裂解從細(xì)菌體釋放的DNA分子斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交檢測(cè)固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

52DNA變性中和Southern印跡預(yù)雜交雜交洗膜檢測(cè)

第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

一、Southern印跡雜交

53

毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

一、Southern印跡雜交

54電轉(zhuǎn)移示意圖第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

一、Southern印跡雜交

55Northern印跡(Northernblot)雜交是應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的另一種膜上印跡技術(shù)是由Alwine于1977年建立的。后經(jīng)Thomas等人改進(jìn)主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的轉(zhuǎn)錄情況第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

二、Northern印跡雜交56Northern印跡雜交流程圖

第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

二、Northern印跡雜交57與Southern印跡雜交比較：RNA提取過(guò)程中需特別注意RNA酶的污染所用的器材最好與Southern印跡實(shí)驗(yàn)的分開使用RNA變性的方法：不能用堿變性，因?yàn)閴A會(huì)水解RNA2’-OH變性劑的作用：防止RNA分子形成發(fā)夾式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以保持其單鏈線形狀態(tài)第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

二、Northern印跡雜交58斑點(diǎn)雜交正向：是將待檢樣（DNA、RNA或細(xì)胞）直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定反向：是將探針固定第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

三、斑點(diǎn)雜交（Dot-blot）59斑點(diǎn)雜交不需電泳和轉(zhuǎn)膜過(guò)程，整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快速特別適合做點(diǎn)突變第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

三、斑點(diǎn)雜交（Dot-blot）60線粒體DNA的8個(gè)突變位點(diǎn)膜雜交結(jié)果32563290331633943593360636183688野生型突變型3290T→C

3593T→C3394T→C3618T→C3316G→A3606A→GC3256TG3316AG3688C第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

三、斑點(diǎn)雜交（Dot-blot）61菌落雜交示意圖第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

四、菌落雜交62原位雜交（Insituhybridization）是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中