免疫組化試劑驗(yàn)證試驗(yàn)記錄表

1、免疫組化試劑驗(yàn)證試驗(yàn)記錄表儀器、設(shè)備：移液器、免疫組化筆、微波爐或高壓鍋、計(jì)時(shí)器、孵育濕盒、染色架、 蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、洗瓶等。溶液配制:PBS溶液配制；EDTA組織抗原修復(fù)液及DAB顯色液使用詳見免疫組化 試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書操作步驟。實(shí)驗(yàn)溫度：15-28C實(shí)驗(yàn)步驟：脫蠟水化1）石蠟切片置于新鮮的二甲苯中，浸泡15 minx 2次；2）去除多余的液體后，置無(wú)水乙醇中，浸泡3 min x 2次;3）去除多余的液體后，置95%乙醇中，浸泡3 min ;4）去除多余的液體后，置85%乙醇中，浸泡3 min ;5）自來(lái)水沖洗1 min ;6）PBS溶液沖洗3 minx 3次。加熱EDTA抗原修復(fù)液（試

2、劑1,采用微波進(jìn)行抗原修復(fù)）1）將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯（或修復(fù)盒）中的耐高溫塑料切片架上;2）加適量的修復(fù)液1x EDTA抗原修復(fù)液，（溶液1,用純凈水稀釋20倍后）于燒杯中，液面要浸過(guò)切片組織一定高度;3）微波爐先用高檔加熱使液體沸騰，當(dāng)加熱至沸騰時(shí)調(diào)到中檔，此時(shí)開始計(jì)時(shí)，修復(fù)時(shí)間一般為20 min，此過(guò)程中勿使組織干片（修復(fù)液要足量）；4）將燒杯從微波爐中拿出，放入冷水中冷卻降溫；5）當(dāng)修復(fù)液降至室溫后取出玻片用PBS（ PH7.4 ）沖洗3 minx 3次。 注意：抗原修復(fù)時(shí)，修復(fù)液務(wù)必保證切片始終浸泡在液體內(nèi)，一般情況：修復(fù) 液的量為800 mL/1架-1500 mL/3架；取

3、出玻片，用PBS沖洗時(shí)，切勿對(duì)著組織沖洗，以免弄破組織。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶1）用吸水紙擦干玻片，免疫組畫筆在組織周圍畫圈；2）將3%的過(guò)氧化氫（試劑2 ），滴加100 pL到切片組織上以阻斷內(nèi) 源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15 min ；3）PBS 沖洗 3 min x 3 次。封閉用吸水紙擦干玻片，滴加正常山羊血清（試劑3 ），室溫封閉15 min , 以減少非特異性染色。一抗孵育1）用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體；2）滴加單克隆抗體（試劑4）100 pL,如果做陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì) 照組的組織上滴加PBS作為陰性對(duì)照，置于濕盒中室溫孵育1h或4C孵育過(guò) 夜。6.復(fù)溫1）樣本4工過(guò)夜從冰箱拿出

4、后需在室溫下孵育15 min復(fù)溫（抗體孵育 為4工過(guò)夜選用此步驟，如室溫孵育直接進(jìn)入下一步清洗）；2）PBS 沖洗 3 min x 3 次。加聚合物輔助劑（試劑5）1）吸水紙擦干切片后滴加試劑5 （ Polymer Helper）,室溫或37工孵 育 20 min ;2）PBS 沖洗 3 min x3 次。二抗孵育1）吸水紙擦干切片后滴加試劑6（Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG ），室溫或 37C孵育 20 min ;2）PBS 沖洗 3 min x 4 次。9.顯色1）甩去PBS液，吸水紙擦干切片；2）每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液100 pK試劑7