07紫外可見吸收光譜法

1、第五章 紫外可見分光光度法 (UV-Vis Spectroscopy)2主要內(nèi)容一、紫外可見吸收光譜二、光的吸收定律三、紫外可見分光光度計(jì)四、紫外-可見分光光度法的應(yīng)用3r 0.0050.050eV 遠(yuǎn)紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜v 0.05eV 紅外光譜或分子振動光譜e 120eV 紫外可見光譜或分子的電子光譜一、紫外可見吸收光譜4一、紫外可見吸收光譜 2. 可見吸收光譜：電子躍遷光譜 吸收光波長范圍400780 nm ，主要用于有色 物質(zhì)的定量分析。1. 紫外吸收光譜：電子躍遷光譜 吸收光波長范圍200400 nm（近紫外區(qū)） ，可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。特點(diǎn)靈敏度較高選擇性較好通用性強(qiáng)準(zhǔn)確度較

2、好操作簡單價格低廉5 吸收曲線與最大吸收波長 max 用不同波長的單色光照射，測吸光度。不同濃度的溶液，測吸光度。一、紫外可見吸收光譜吸收曲線:表明吸光物質(zhì)溶液對不同波長的光的吸收能力不同的曲線叫吸收曲線，也叫吸收光譜。62. 同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長max ；3. 不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似max不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和max則不同；1. 吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內(nèi)部能級分布狀況，是物質(zhì)定性的依據(jù)；4. 吸收譜帶的強(qiáng)度與該物質(zhì)分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。一

3、、紫外可見吸收光譜7（一）有機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜分子中外層價電子躍遷的結(jié)果（三種）：電子、電子、n電子.分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應(yīng)的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài),即成鍵軌道或非鍵軌道上。當(dāng)外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷，所需能量大小順序?yàn)椋?n n 200 nm）含有不飽和鍵的有機(jī)分子易發(fā)生這類躍遷 C=C; C=C ; N=N ; C=O有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜分析多以這兩類躍遷為基礎(chǔ) * 比 n * 躍遷幾率大 100-1000 倍 *躍遷吸收強(qiáng)， 104n * 躍遷吸收弱， 5003. * 和 n *

4、 躍遷11紫外光譜中常用的術(shù)語生色團(tuán)：分子中含有非鍵或鍵的電子體系，能吸收外來輻射時并引起n- *和 - *躍遷，可產(chǎn)生此類躍遷或吸收的結(jié)構(gòu)單元，稱為生色團(tuán)。12助色團(tuán) : 帶有非鍵電子對的基團(tuán)，如-OH、 -OR、 -NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當(dāng)它們與生色團(tuán)相連時，會使生色團(tuán)的吸收峰向長波方向移動，并且增加其吸光度。紫外光譜中常用的術(shù)語13生色團(tuán) 含有 鍵不飽和官能團(tuán)；助色團(tuán) 基團(tuán)本身無色，但能增強(qiáng)生色團(tuán)顏色, 為含有n電子，且能與電子作用,產(chǎn)生 n 共軛.184204254270苯（ *） 苯酚（OH為助色團(tuán)）/nm紫外光譜中常用的術(shù)語

5、14紅移與藍(lán)移 有機(jī)化合物的吸收譜帶因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLmax和吸收強(qiáng)度發(fā)生變化: 某些有機(jī)化合物經(jīng)取代反應(yīng)引入含有未共享電子對的基團(tuán)（ -OH、 -OR、 -NH2、-SH 、-Cl、-Br、-SR、- NR2 ）后，吸收峰的波長將向長波方向移動，這種效應(yīng)稱為紅移效應(yīng)。在某些生色團(tuán)如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波長會向短波方向移動，這種效應(yīng)稱為藍(lán)移效應(yīng)，如-R，-OCOR。紫外光譜中常用的術(shù)語15促使分子發(fā)生紅移或藍(lán)移的因素1）共軛體系的存在-紅移 如CH2=CH2的-*躍遷，max=165200nm；而1,3-丁二烯，max=217nm2）異構(gòu)現(xiàn)象-使異構(gòu)物

6、光譜出現(xiàn)差異 如乙酰乙酸乙酯在溶液中存在酮式與烯醇式的平衡，烯醇式中的共軛雙鍵使-*躍遷能量降低， max紅移.3）空間異構(gòu)效應(yīng)-紅移 如CH3I(258nm), CH2I2(289nm), CHI3(349nm)164）取代基-紅移或藍(lán)移 取代基為含孤對電子，如-NH2、-OH、-Cl，可使分子紅移；取代基為斥電子基，如-R，-OCOR則使分子藍(lán)移； 苯環(huán)或烯烴上的H被各種取代基取代，多產(chǎn)生紅移.5）pH值-紅移或藍(lán)移 苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm兩個吸收帶；而在堿性溶液中，則分別紅移到235nm和 287nm6）溶劑效應(yīng)-紅移或藍(lán)移 n-*躍遷產(chǎn)生的吸收峰，隨溶劑

7、極性增加，發(fā)生藍(lán)移； -*躍遷產(chǎn)生的吸收峰，隨溶劑極性增加，發(fā)生紅移.促使分子發(fā)生紅移或藍(lán)移的因素17有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜 1. 飽和烴及其取代衍生物 飽和烴類分子中只含有鍵，只能產(chǎn)生*躍遷.飽和烴的最大吸收峰一般小于150 nm，超出紫外、可見分光光度計(jì)的測量范圍. 飽和烴的取代衍生物如鹵代烴，其鹵素原子上存在n電子，可產(chǎn)生n* 的躍遷。 n* 的能量低于*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n* 躍遷分別出現(xiàn)在173、204和258nm處。氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相應(yīng)的吸收波長發(fā)生了紅移，顯示了助色團(tuán)的助色作用. 直接用烷烴和鹵代烴的紫外吸收光譜分析這些化合物的實(shí)用價值不

8、大。但它們是測定紫外和（或）可見吸收光譜的良好溶劑.182. 不飽和烴及共軛烯烴 在不飽和烴類分子中，除含有鍵外，還含有鍵，它們可以產(chǎn)生*和*兩種躍遷。 *躍遷的能量小于 *躍遷。例如，在乙烯分子中， *躍遷最大吸收波長為180nm. 在不飽和烴類分子中，當(dāng)有兩個以上的雙鍵共軛時，隨著共軛系統(tǒng)的延長， *躍遷的吸收帶 將明顯向長波方向移動，吸收強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。在共軛體系中， *躍遷產(chǎn)生的吸收帶又稱為K帶. 有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜193. 羰基化合物 羰基化合物含有C=O基團(tuán)。 C=O基團(tuán)主要可產(chǎn)生*、 n* 、n*三個吸收帶， n*吸收帶又稱R帶，落于近紫外或紫外光區(qū)。醛、酮、羧酸及羧酸

9、的衍生物，如酯、酰胺等. 羧酸及羧酸的衍生物雖然也有n*吸收帶，但是， 羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接連結(jié)含有未共用電子對的助色團(tuán)，如-OH、-Cl、-OR等，由于助色團(tuán)上的n電子與羰基雙鍵的電子產(chǎn)生n共軛，導(dǎo)致*軌道的能級有所提高，使n* 躍遷所需的能量變大，n*吸收帶藍(lán)移至210nm左右.有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜204. 苯及其衍生物 苯有三個吸收帶，它們都是由*躍遷引起的。E1帶出現(xiàn)在180 nm（max = 60，000）； E2帶出現(xiàn)在204 nm（ max = 8000 ）；B帶出現(xiàn)在255 nm （max = 200）. 在氣態(tài)或非極性溶劑中，苯及其許多同系物的B譜帶

10、有許多的精細(xì)結(jié)構(gòu)，這是由于振動躍遷在基態(tài)電子上的躍遷上的疊加而引起的. 在極性溶劑中，這些精細(xì)結(jié)構(gòu)消失,當(dāng)苯環(huán)上有取代基時，苯的三個特征譜帶都會發(fā)生顯著的變化，其中影響較大的是E2帶和B譜帶.有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜215. 稠環(huán)芳烴及雜環(huán)化合物 稠環(huán)芳烴，如奈、蒽、芘等，均顯示苯的三個吸收帶，但這三個吸收帶均發(fā)生紅移，且強(qiáng)度增加。隨著苯環(huán)數(shù)目的增多，吸收波長紅移越多，吸收強(qiáng)度也相應(yīng)增加. 當(dāng)芳環(huán)上的-CH基團(tuán)被氮原子取代后，則相應(yīng)的氮雜環(huán)化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光譜，與相應(yīng)的碳化合物極為相似，即吡啶與苯相似，喹啉與奈相似。此外由于引入含有n電子的N原子的，這類雜環(huán)化合物還可能產(chǎn)生n*

11、吸收帶.有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜22溶劑對紫外吸收光譜的影響1. 溶劑的極性 溶劑極性越強(qiáng)，由躍遷產(chǎn)生的譜帶向長波方向移動越顯著，即紅移越大。這是因?yàn)榘l(fā)生躍遷的分子激發(fā)態(tài)的極性大于基態(tài)，在極性溶劑的作用下，激發(fā)態(tài)能量降低的程度大于基態(tài)，從而使基態(tài)到激發(fā)態(tài)躍遷所需的能量變小，使吸收帶發(fā)生紅移. 溶劑極性越強(qiáng)，由n躍遷產(chǎn)生的譜帶向短波方向移動越明顯，即藍(lán)移越大。發(fā)生n躍遷的分子都含有未成鍵的孤對電子，與極性溶劑形成氫鍵，使得分子的非鍵軌道能量有較大程度的降低，使n躍遷所需的能量相應(yīng)增大，致使吸收譜帶發(fā)生藍(lán)移.232. pH值對紫外光譜的影響 pH值的改變可能引起共軛體系的延長或縮短，從而引起吸

12、收峰位置的改變，對一些不飽和酸、烯醇、酚及苯胺類化合物的紫外光譜影響很大，如果化合物溶液變?yōu)閴A性，吸收峰發(fā)生紅移，表明該化合物可能為酸性物質(zhì)；如果變?yōu)樗嵝?，發(fā)生藍(lán)移，可能為堿性物質(zhì).例如：苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm兩個吸收帶；而在堿性溶液中，則分別紅移到235nm和 287nm（p- 共軛）.溶劑對紫外吸收光譜的影響24一、紫外可見吸收光譜（二）無機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜1. 配位體微擾的金屬離子d-d電子躍遷和f-f電子躍遷 d-d (過渡金屬），f-f（鑭系錒系） 吸收系數(shù)max 較小 (102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物結(jié)構(gòu)及其鍵合理論. 2. 金

13、屬離子微擾的配位體內(nèi)電子躍遷 金屬離子的微擾，將引起配位體吸收波長和強(qiáng)度的變化。變化與成鍵性質(zhì)有關(guān)，若靜電引力結(jié)合，變化一般很小。若共價鍵和配位鍵結(jié)合，則變化非常明顯.25一、紫外可見吸收光譜（二）無機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜 3. 電荷轉(zhuǎn)移吸收光譜max 較大 (104以上)，在分光光度法中具有重要意義. 當(dāng)吸收紫外可見輻射后，分子中原定域在金屬M(fèi)軌道上電荷的轉(zhuǎn)移到配位體L的軌道，或按相反方向轉(zhuǎn)移，這種躍遷稱為電荷轉(zhuǎn)移躍遷，所產(chǎn)生的吸收光譜稱為荷移光譜.26二、光的吸收定律 朗伯比耳定律布格(Bouguer) 1729年朗伯(Lambert) 1760年光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系 Ab2

14、7比耳(Beer) 1852年 朗伯比耳定律光的吸收程度和吸收物濃度之間的關(guān)系 A c二、光的吸收定律28光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系A(chǔ)b光的吸收程度和吸收物濃度之間的關(guān)系 A c 朗伯比耳定律 A= bc吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)朗伯(Lambert)比耳(Beer)二、光的吸收定律29A：吸光度 - 溶液對光的吸收程度b：液層厚度(光程長度,cm)c：溶液的摩爾濃度，molL：摩爾吸光系數(shù)，LmolcmAlg（I0/It)= b c濃度為1 mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度Alg（I0/It)= a b cc：溶液的濃度，g L a：吸光系數(shù)，L g c

15、m 濃度為1 g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度aa =/M （M為摩爾質(zhì)量） 二、光的吸收定律301.摩爾吸光系數(shù)不隨濃度c和光程長度b的改變而改變，在溫度和波長等條件一定時，僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān);同一吸收物質(zhì)在不同波長下的值是不同的。在最大吸收波長max處的摩爾吸光系數(shù)，常以max表示。代表可能達(dá)到的最大靈敏度;max越大表明光度法測定該物質(zhì)靈敏度越高105：超高靈敏；=(610）104 ：高靈敏; 60nm. 821.顯色劑用量顯色條件的選擇 將待測組分的濃度及其它條件固定，加入不同量的顯色劑，測定吸光度，繪制A與c的關(guān)系曲線.(a) 可在ab范圍間選擇合適的顯色

16、劑用量，生成的絡(luò)合物比較穩(wěn)定，對顯色劑濃度要求不高，適用于光度分析.(b)應(yīng)選ab之間所對應(yīng)的顯色劑濃度，b后吸光度下降，說明有副反應(yīng)發(fā)生.(c) 嚴(yán)格控制顯色劑用量.83OH-2.反應(yīng)體系的酸度副反應(yīng)M + nR = MRnH+存在型體的變化RH = R- + H+ 生成不同配比的絡(luò)合物例: Fe 3+ 磺基水楊酸(ssal)紫紅色pH = 8 10 FeR3 pH12 Fe(OH)3橙色黃色 沉淀顯色條件的選擇pH = 4 7 FeR2pH = 2 3 FeR842.反應(yīng)體系的酸度顯色條件的選擇 固定待測組分及顯色劑濃度，改變?nèi)芤簆H值，測定吸光度，作出A-pH曲線，選擇曲線平坦部分對應(yīng)的

17、pH值作為測定條件.ApH選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū).85例如：鄰二氮菲亞鐵的反應(yīng)pH38(檸檬酸鹽介質(zhì))為適宜的酸度范圍.2+33NNFe+ Fe2+桔紅色 max顯色條件的選擇86顯色條件的選擇3.顯色溫度通過實(shí)驗(yàn)確定適宜溫度范圍.4.顯色時間 繪制吸光度-時間曲線，曲線平坦部分所對應(yīng)的時間就是測定時的最佳時間.2550t /minA87測Fe3: (控制pH)Fe3+, Cu2+Fe(ssal)+（紫紅）Cu2+pH 2.5ssal5.共存干擾離子的消除 1)控制酸度:使穩(wěn)定性高的被測離子絡(luò)合物定量形成，使穩(wěn)定性低的干擾離子絡(luò)合物不能形成.顯色條件的選擇88Co(SCN)2 (藍(lán)

18、)測Co2(含F(xiàn)e3+) : (掩蔽法)顯色條件的選擇5.共存干擾離子的消除 Co2, Fe3+Co2+FeF63-NaFSCN-2)加入掩蔽劑: 加入掩蔽劑是消除干擾常用的方法，如用KSCN測Co2+，F(xiàn)e3+干擾可加入NaF生成無色的FeF63-而消除895.共存干擾離子的消除 顯色條件的選擇3)分離干擾離子:萃取法、離子交換法、沉淀法及電解法等.如不能通過控制酸度和掩蔽的辦法消除干擾，則需采取分離法.901.選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL 一般應(yīng)該選擇max為入射光波長。但如果max處有共存組分干擾時，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長.2.控制適宜的吸光度（讀數(shù)范圍）Tmin36.8%

19、, Amin0.434最佳讀數(shù)范圍T %=70 10A = 0.151.0吸光度測量條件的選擇91 3.選擇合適的參比溶液若僅待測組分與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，其它試劑均無吸收，用純?nèi)軇ㄋ?作參比溶液；若顯色劑或其它試劑略有吸收，試液本身無吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；若待測試液有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液.吸光度測量條件的選擇92測定依據(jù)朗伯-比爾定律采用 A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定單組分的測定c1c2c3c4c5A1A2A3A4A5A。 。 。 。*0.800.600.400.200.00Axcx 0 1.0 2.0 3.0 4.0

20、 c(mg/mL)93硫酸銅中Fe3+的測定1. 實(shí)驗(yàn)原理: 在稀酸性溶液中, Fe3+與SCN-生成紅色配合物溶液： (血紅色)Fe3+越多,紅色愈深. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明:有色溶液對光的吸收程度與溶液中有色物質(zhì)的濃度和液層厚度的乘積成對比.這就是朗伯-比爾定律,其數(shù)學(xué)表達(dá)式為 A = bc942.儀器和藥品: (1) 儀器: 722型分光光度計(jì),分析天平, 移液管, 吸量管，容量瓶等；(2) 藥品: 硝酸，KCNS(20%), CuSO45H2O(學(xué)生實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品), 氨水，硫酸，H2O2(3%);鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取一定質(zhì)量的NH4Fe(SO4)2, 置于燒杯中加入少許1:1HNO3溶液, 再加少量去

21、離子水,將溶液轉(zhuǎn)移到1000ml容量瓶中,用去離子水稀釋到刻度.硫酸銅中Fe3+的測定953.實(shí)驗(yàn)步驟:（1）鐵標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制容量瓶號1#2#3#4#5#6#1:1HNO32.00ml2.00ml2.00ml2.00ml2.00ml2.00ml20%KCNS5.00ml5.00ml5.00ml5.00ml5.00ml5.00ml鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00ml0.50ml1.00ml1.50ml2.00ml2.50ml（2）吸收曲線的繪制/nm460470475480485490500 A硫酸銅中Fe3+的測定96（3）工作曲線的繪制 （4）產(chǎn)品CuSO45H2O中鐵的測定硫酸銅中Fe3+的測定cA

22、Axcx97乳酸司帕沙星葡萄糖注射液測定 司帕沙星( Sparf lox acin) 是一代優(yōu)良的氟喹諾酮類抗菌素, 對革蘭氏陽性菌、厭氧菌、支原體、衣原體, 結(jié)核桿菌和革蘭氏陰性菌都有極強(qiáng)的抗菌活性. 紫外分光光度計(jì)( 日立U V-2000 型和菲利浦PU-8800 型) . 司帕沙星對照品(含量99. 76% ) ; 乳酸司帕沙星葡萄糖注射液; 乳酸液( 0. 1mol / L). 精取司帕沙星對照品適量, 以乳酸液配制成約5g / ml 濃度的司帕沙星對照品溶液. 以乳酸液為參比, 在250400 nm 波長范圍內(nèi)掃描司帕沙星對照品溶液.98乳酸司帕沙星葡萄糖注射液測定 以0. 1mmo

23、l / L 乳酸液為參比, 在298 nm 波長處測定司帕沙星對照品吸光度. 結(jié)果在2. 012. 0 Lg/ ml 濃度范圍內(nèi), 吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系.（A= 0. 0782C + 3. 7104， r = 0. 9999） 99乳酸司帕沙星葡萄糖注射液測定回收率試驗(yàn)結(jié)論：采用紫外分光光度法在司帕沙星的最大吸收波長( 298nm) 處測定其含量, 輔料無干擾, 重復(fù)性好, 準(zhǔn)確可靠, 且操作簡便快速, 適合于本品的常規(guī)分析.100酚荷搽劑中苯酚的含量測定 酚荷搽劑是苯酚、薄荷腦、甘油、75%乙醇配制成的一種搽劑。以0. 02% 甘油-乙醇( 75%) 溶液作空白, 在270nm 處測

24、定上述系列濃度的吸收度( A ). 結(jié)果表明, 苯酚在10. 060. 0 Lg / ml 范圍內(nèi), 吸收度與濃度線性關(guān)系良好. A = 0. 015 79 C + 0. 010 67, r = 0. 9996 UV-120紫外分光光度儀( 日本島津) ; 分析天平( 上海天平儀器廠) ; 苯酚( 沈陽化學(xué)制藥廠) ; 薄荷腦( 淮安制藥廠) ;甘油( 南通中寶醫(yī)藥保健品有限公司) .101酚荷搽劑中苯酚的含量測定結(jié)論：利用UV-Vis測定酚荷搽劑中苯酚，操作簡單快速、 結(jié)果準(zhǔn)確，線性關(guān)系良好；與溴量法測定結(jié)果一致; 本法適用于該制劑的質(zhì)量控制.102由于吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中

25、測定多個組份.多組分的同時測定設(shè)試樣中有兩組份 X 和 Y，將其顯色后，分別繪制吸收曲線.103若X,Y組分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長處分別進(jìn)行測定,可以按兩個單一組份處理，如圖（a)所示.若X,Y組分的吸收曲線互有重疊，如圖（b)和（c)所示，則可根據(jù)吸光度的加合性解聯(lián)立方程組得出cx 及 cy的含量.多組分的同時測定104復(fù)方苯甲酸酊含量的測定 復(fù)方苯甲酸酊系中國醫(yī)院制劑規(guī)范西藥二版收載品種. 處方組成: A 方, 苯甲酸60 g, 水楊酸30 g, 75%乙醇加至1 000 ml; B 方, 苯甲酸120g , 水楊酸60 g, 75%乙醇加至1 000 ml. 臨床用于

26、治療干燥未破裂手足癬, 疊瓦癬等癥, 療效較好. 規(guī)范中對該制劑的含量測定是利用酸堿滴定法, 只能測定苯甲酸與水楊酸的總酸量, 無法分別測定苯甲酸與水楊酸的含量. 本文應(yīng)用雙波長分光光度法, 不經(jīng)分離, 即可分別測定苯甲酸與水楊酸的含量.105復(fù)方苯甲酸酊含量的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：苯甲酸在24 96 g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好( r= 0. 999 9) ; 水楊酸在6 36 g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好( r= 0. 9999) . 53WB 紫外分光光度計(jì)( 上海光學(xué)儀器廠) , 樣品為醫(yī)院自制.苯甲酸的 max 為275 nm,水楊酸的 max 為302 nm.106復(fù)方苯甲酸酊含量的測定

27、 結(jié)論：本方法不僅能同時測定苯甲酸與水楊酸的含量, 而且簡便、快速, 結(jié)果與酸堿法一致, 可作為醫(yī)院制劑的快速檢驗(yàn)方法.107高含量組分的測定-示差法 吸光光度法適用于微量組分的測定，當(dāng)待測定組分濃度過高時，測得的吸光度值常常偏離朗伯-比爾定律.即使沒有偏離，通常采用純?nèi)軇┳鲄⒈仁刮舛葴y量值過大，超出適宜讀數(shù)范圍引入較大誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度大為降低，采用示差法可克服這一缺點(diǎn). 示差法又稱為示差分光光度法. 它與一般分光光度法區(qū)別在于它采用一個已知濃度作參比溶液，從而提高了測定的準(zhǔn)確度，使其用于測定過高含量的組分，所以將這種吸光度測量方法來擴(kuò)大測量范圍并提高靈敏度和準(zhǔn)確度的方法稱之為示差法.108

28、示差法：以濃度為 Cs 的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比（Cx Cs） 適宜高濃度組分的測定. 標(biāo)準(zhǔn)溶液cs 、 c1、 c2、c3; 以cs作參比，調(diào)A = 0; 測 c1 、 c2、c3的A; 用A對c作圖; 同條件下測Ax; 從示差工作曲線中查出cx. 高含量組分的測定-示差法ACCxAx示差工作曲線Ax109高含量組分的測定-示差法TxT051050100T051050100Tr,xTsTs常規(guī)法示差法示差法提高準(zhǔn)確度的實(shí)質(zhì)標(biāo)尺擴(kuò)展10倍結(jié)論：示差法通過提高測量的準(zhǔn)確度提高了方法的準(zhǔn)確度.110高濃度含磷廢水的測定 廢水中總磷濃度是經(jīng)常變化的，遇到含磷量高的水樣，用分光光度法測量時，吸光度超出了準(zhǔn)確測

29、量讀數(shù)范圍，只有將水樣稀釋消解處理后，才能進(jìn)行分析. 而每次處理大約需要30-40min(鉑銻抗分光光度法)，比較費(fèi)時. 有時一次消解達(dá)不到要求，還需進(jìn)行二次消解. 示差法: 用已知濃度的標(biāo)淮作參比調(diào)零，再進(jìn)行樣品的測試。用所測得的吸光度值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其含量(m2)，再計(jì)算出參比液的含量(m1)，兩者之和即為樣品的含量.111高濃度含磷廢水的測定112高濃度含磷廢水的測定示差法解決了高含磷廢水分析問題，具有較高的實(shí)用價值.113酸堿離解常數(shù)的測定HBH+B-Ka =H+B-HB(1)pKa=pH+lgHBB-設(shè)：b=1cmA=A HB +AB-例如：一元弱酸HB114A=HB（c- B-)

30、 +B-B- = HBc+B- (B- HB)同理由（2）得： A=HBHB+ B-(c-HB) = B-c+HB (HB- B-)B-=A -HB cB- HB則：A=A HB +AB-=HBHB+ B-B- (2)HB=B-c-AB- HB(3)(4)將（3）（4）代入（1）中：Ka =H+B-HBC=HB+B-酸堿離解常數(shù)的測定115Ka=H+(A -HB c)B-c-AA HB=HB cAB-=B-c定義：A -AHBKa=H+AB-ApKa=pH+lgA -AHBAB-A酸堿離解常數(shù)的測定1161. 摩爾比法(飽和法)2. 連續(xù)變化法 配合物組成和穩(wěn)定常數(shù)測定設(shè)金屬離子M與配合劑L的

31、顯色反應(yīng)為： M + nR MRn固定cM，增加cR，并測定一系列MRn的吸光度A，以cR/cM比值對A作圖，得如圖所示曲線。其中，曲線拐點(diǎn)處對應(yīng)的值為配合比 n.A1A2117配合物組成和穩(wěn)定常數(shù)測定設(shè)MRn電離度為，則其中 = (A1-A2)/A1，將代入公式(1)求得穩(wěn)：(1)()118 蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命.蛋白質(zhì)的定量分析方法雙縮脲法Lowry法Bradford法BCA法紫外光譜吸收法凱氏定氮法119雙縮脲法 原理：蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵，故有雙縮脲 （NH2-CO-NH-CO-NH2）反應(yīng). 在堿性條件下，肽鍵的質(zhì)子被解離，Cu2+和失去

32、質(zhì)子的多肽鏈的氮相結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，在540560 nm的光吸收值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系. 可以認(rèn)為雙縮脲反應(yīng)是蛋白質(zhì)特有的反應(yīng). 120Lowry法 Lowry法是在Folin酚試劑法和雙縮脲法的基礎(chǔ)上建立.原理：第一步反應(yīng)：在堿性溶液中蛋白與Cu2+反應(yīng)形成紫紅色的絡(luò)合物； 第二步反應(yīng)：酚試劑（磷鉬酸和磷鎢酸混合液）與蛋白質(zhì)芳香族氨基酸反應(yīng)呈深藍(lán)色. 其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可用于定量分析.優(yōu)點(diǎn)：此法較雙縮脲法靈敏.同時分析多個樣品，簡便；靈敏度提高.121Bradford法基本原理：考馬斯亮藍(lán)G-250在一定條件下可與蛋白質(zhì)結(jié)合，使其顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收峰從465nm移至595nm，其吸收度與蛋白質(zhì)濃度成正比.優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，配合酶標(biāo)儀，可同時測定多個樣品；對干擾劑不敏感.目前絕大多數(shù)公司都提供基于此原理的蛋白質(zhì)定量試劑盒.122BCA法 原理：BCA（bicinchoninic acid）是對一價銅離子（Cu+）敏感、穩(wěn)定和高特異性的試劑。在堿性溶液中，