消瘀化痰方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝細(xì)胞凋亡和Caspase3蛋白表達(dá)的

1、消瘀化痰方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝細(xì)胞凋亡和Caspase3蛋白表達(dá)的【摘要】目的觀察中藥消瘀化痰方對(duì)非酒精性脂肪肝NAFLD大鼠肝細(xì)胞凋亡和肝組織aspase3蛋白表達(dá)的影響，討論其防治NAFLD的局部作用機(jī)理。方法采用高脂飲食喂飼大鼠復(fù)制NAFLD模型，以東寶肝泰為對(duì)照藥，運(yùn)用流式細(xì)胞儀觀察各組大鼠肝細(xì)胞凋亡及肝組織aspase3蛋白表達(dá)的變化，同時(shí)采用HE染色觀察各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果鏡下可見(jiàn)模型組大鼠肝臟中度以上脂肪變性，并有少量的肝細(xì)胞壞死；流式細(xì)胞術(shù)分析可見(jiàn)其細(xì)胞凋亡率明顯增高P0.01，aspase3蛋白表達(dá)FI值增高P0.01。與模型組比擬，各用藥組肝脂變程度顯著改善，肝

2、細(xì)胞的凋亡率明顯下降P0.01，aspase3蛋白表達(dá)FI值降低P0.01。結(jié)論消瘀化痰方通過(guò)抑制aspase3蛋白的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的凋亡，以到達(dá)抗脂肪肝作用?！娟P(guān)鍵詞】消瘀化痰方非酒精性脂肪肝細(xì)胞凋亡aspase3蛋白Abstrat:bjetiveTbservetheeffetfXia-Yu-Hua-Tan-Yinnhepatiapptsisandaspase3innnalhlifattyliverrats(NAFLD).ethdsThennalhlifattyliverratdelasfedbyhighfatfrage,andDngbagantaiastreatedasntrlgrup.

3、Flytetry(F)asusedtdetetthehepatiapptsisandexpressinfaspase3,andptialirspeasusedtbservethedegreefhepatisteatsis.ResultsLiverellsshedediurseriussteatsisbyptialirspe,andafehepatinersis.Theratefellapptsisandexpressinfaspase3detetedbyFinthedelgrupassignifiantlyinreased(P0.01).parediththedelgrup,liverfate

4、lldenaturizingasiprved,andtheratefellapptsisandexpressinfaspase3assignifiantlydereasedineahtreatentgrup(P0.01).nlusinXia-Yu-Hua-Tan-Fanganinhibithepatiapptsisinhibitingbytheexpressinfaspase3,andprtetnnalhlifattyliver.Keyrds:Xia-Yu-Hua-Tan-Fang;Nnalhlifattyliverdisease；ellapptsis;aspase3prtEin消瘀化痰方為筆

5、者在臨床上治療非酒精性脂肪肝NAFLD的效方，既往藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其具有顯著的調(diào)節(jié)血脂和抗脂肪肝作用1，但其治療作用機(jī)制尚不非常清楚。研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞的凋亡與增生在NAFLD的病理變化中非常顯著2。但是，有關(guān)中藥對(duì)NAFLD肝細(xì)胞凋亡影響的研究報(bào)道較少，本研究旨在通過(guò)觀察消瘀化痰方對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞凋亡及肝組織aspase3蛋白表達(dá)的影響，以討論其作用機(jī)制。1材料與儀器1.2藥物及試劑消瘀化痰方的組成與制備：消瘀化痰方由澤瀉、丹參、海藻、生黃芪、制半夏、生大黃、郁金、決明子、生山楂、柴胡、炒白術(shù)組成，以上藥物先用乙醇提取，揮發(fā)去酒精，然后將全部藥渣加水適量，普通方法煎煮，將提取液與煎煮液混

6、合，濃縮成所需濃度。東寶肝泰片：通化東寶藥業(yè)股份出品，批號(hào)為H22024764。實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度的混懸液。碘化丙啶、RNA酶、鼠抗人aspase3蛋白單克隆抗體、羊抗鼠FIT-IgG等均由美國(guó)siga公司提供。1.3儀器FASan-420型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BektnDikinsn公司產(chǎn)品。2方法2.1動(dòng)物分組與造模50只安康雄性SD大鼠，飼養(yǎng)于1822明暗各12h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即：正常對(duì)照組簡(jiǎn)稱正常組，模型對(duì)照組簡(jiǎn)稱模型組，消瘀化痰方高、低劑量組簡(jiǎn)稱高、低劑量組，陽(yáng)性藥東寶肝泰對(duì)照組簡(jiǎn)稱對(duì)照組。動(dòng)物造模參照文獻(xiàn)3喂飼高脂飼料，

7、高脂飼料由1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、10%豬油和88%根底飼料制成。除正常組喂飼普通飼料外，其余各組均給予高脂飼料，連續(xù)9周。2.2給藥方法及標(biāo)本處理大鼠造模的同時(shí)，各組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，給藥劑量按藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)計(jì)算，消瘀化痰方高、低劑量組分別按43.34，21.67g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服，對(duì)照組按0.9g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服，正常組和模型組灌服生理鹽水。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1l/100g計(jì)算。實(shí)驗(yàn)9周末，最后1次給藥后禁食12h麻醉狀態(tài)下迅速剖取肝臟，在肝臟最大葉距邊緣0.5處取少許肝組織，生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分，70乙醇溶液固定，4冰箱冷貯待檢。另在一樣部位取

8、0.50.50.5大小的肝組織浸泡于4多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)變化。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3指標(biāo)檢測(cè)2.3.1肝組織形態(tài)學(xué)觀察取大鼠局部肝組織用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。2.3.2肝細(xì)胞凋亡及肝組織aspase3蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析單細(xì)胞懸液的制備：取已固定肝組織放于120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎至111大小，輕搓組織，邊搓邊以PBS液沖洗，直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目篩網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，搜集細(xì)胞懸液，1000r/in，離心3in，棄上清，保存沉淀，參加PBS0.3l，稀釋

9、混勻后，將單細(xì)胞懸液分成2份，調(diào)整每份樣品的細(xì)胞數(shù)為1106，用于檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡DNA含量染色：采用PI一步插入性DNA定量熒光染色方法，染液中含PI50g/l，RNA酶100g/l，Tritn-X1001.0%。取上述制備的單細(xì)胞懸液1份，參加PIDNA熒光染色液1l，置4冰箱染色30in，以500目篩網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。測(cè)量的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用Exp32AD軟件進(jìn)展免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用utiyleAV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期擬合分析。采用Barlgie的細(xì)胞圖解法分析，將處于不同時(shí)期的細(xì)胞分為3局部，即：G0/G1期、S期、G2/期，根據(jù)DNA含量直方圖，由計(jì)算機(jī)計(jì)算出各時(shí)相

10、的分布比率，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)PI。為保證儀器的精度和實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性，檢測(cè)前以fl-hekTFlurpheres10熒光微球REF6605359.Be-kanuiter，In.Fullertn，A92835作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器V值在2以內(nèi)。aspase3蛋白免疫熒光樣品的制備：將1106個(gè)細(xì)胞以PBS洗滌2次，2in/次，離心2in，棄上清液，參加1100的鼠抗人aspase3蛋白單克隆抗體100l，30溫育30in，用PBS離心洗滌2次，棄上清液，參加1100的羊抗鼠FIT-IgG100l，37溫育30in，離心洗滌2次取上清液，除去未結(jié)合的多余熒光抗體，上機(jī)前參加1.0lPBS液，經(jīng)40

11、0目濾網(wǎng)過(guò)濾即可上機(jī)檢測(cè)。2.4資料計(jì)算方法細(xì)胞凋亡指數(shù)appytiindex，AP表示細(xì)胞凋亡程度，計(jì)算10000個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出百分比。細(xì)胞增殖指數(shù)prliferatinindex，PI表示細(xì)胞增殖活性，計(jì)算方法為：PI=S+G2/G0/G1+S+G2/100%。免疫熒光指數(shù)flureseneindex，F(xiàn)I表示蛋白表達(dá)程度，計(jì)算方法為：FI=樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用s表示，采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS軟件進(jìn)展處理，顯著性檢驗(yàn)以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。3結(jié)果3.1肝組織形態(tài)學(xué)改變光鏡下可見(jiàn)，正常組大鼠

12、肝組織構(gòu)造完好、明晰，肝小葉構(gòu)造正常，中央靜脈大而壁薄，肝細(xì)胞排列成肝索，在中央靜脈周?chē)史派錉罘植?，?xì)胞呈多邊形。模型組大鼠肝細(xì)胞中度細(xì)胞水腫，少量的肝細(xì)胞壞死，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡脂肪變性，重度變性者，脂滴空泡交融，呈現(xiàn)中至重度脂肪變性，但未見(jiàn)明顯的纖維化改變。各治療組動(dòng)物肝小葉和肝血竇構(gòu)造明晰，高、低劑量組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴空泡根本消失，對(duì)照組中少量的肝細(xì)胞內(nèi)仍有脂滴空泡，并有輕度的細(xì)胞水腫。3.2肝細(xì)胞凋亡及調(diào)控基因蛋白aspase3的流式細(xì)胞術(shù)分析與正常組比擬，模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡率明顯增高P0.01，aspase3蛋白表達(dá)FI值明顯增高P0.01。經(jīng)用藥干預(yù)后，高

13、、低劑量組及對(duì)照組肝細(xì)胞凋亡率明顯降低P0.01，aspase3蛋白表達(dá)FI值明顯降低P0.01。說(shuō)明隨凋亡率增加，aspase3蛋白表達(dá)量也增加。各治療組中高、低劑量組的肝細(xì)胞凋亡率和aspase3蛋白表達(dá)FI值均低于高劑量組P0.05或P0.05。見(jiàn)表1。表1各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率和肝組織aspase3表達(dá)FI值的比擬略與模型組比擬，*P0.05，*P0.01；與對(duì)照組比擬，P0.05，P0.01；n=104討論NAFLD在古代醫(yī)籍中無(wú)此病名及相關(guān)的描繪，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)的“肝痞“脅痛“肝著“肝壅“痰方等病證的范疇。筆者認(rèn)為NAFLD多由飲食失節(jié)，恣食肥甘厚味，損傷脾胃，使其運(yùn)化失

14、常，釀生痰濁，聚集體內(nèi)，痰阻氣滯，肝失調(diào)達(dá)，血脈瘀阻，痰瘀結(jié)于脅下，形本錢(qián)玻故痰瘀互結(jié)、肝脾失調(diào)為其主要病機(jī)，消痰化瘀、健脾疏肝為其有效治法。因此，精心挑選相關(guān)藥物組成消瘀化痰方，經(jīng)臨床應(yīng)用療效滿意。方中選用澤瀉、制半夏、海藻除水濕、消痰濁；丹參、郁金活血通絡(luò)，祛肝經(jīng)之瘀，增強(qiáng)肝臟血運(yùn)；生大黃通腑導(dǎo)滯，降濁祛脂，與澤瀉配用，分流疏導(dǎo)，使邪有去路；生山楂祛瘀消積；柴胡、決明子疏肝利膽，清肝經(jīng)郁熱；生黃芪、炒白術(shù)補(bǔ)氣健脾，以助痰瘀的運(yùn)除，而且也表達(dá)了“見(jiàn)肝之病，領(lǐng)先實(shí)脾的治療法那么。諸藥合用那么清降痰濁瘀積，調(diào)節(jié)肝脾功能，從而到達(dá)抗脂肪肝的目的。細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶和信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控的一

15、個(gè)“瀑布式激活過(guò)程。近年人們發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)在細(xì)胞凋亡的信息傳遞中具有重要作用的蛋白酶家族aspase，目前已發(fā)現(xiàn)該家族中有16個(gè)成員，aspase3那么是這一家族的重要成員，它處于細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵地位，在各種生理和病理因素刺激下經(jīng)過(guò)多因子復(fù)雜的互相作用后，其底物被激活降解產(chǎn)生終末事件，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)上特征性的凋亡改變，加重組織或器官的功能損害。正常情況下，aspase3以無(wú)活性的酶原形式存在，當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)部或外界因素刺激時(shí)被激活，aspase3裂解為活性體，激活凋亡的級(jí)聯(lián)反響。aspase3激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在細(xì)胞凋亡早期的啟動(dòng)與執(zhí)行過(guò)程中起著重要作用。史洪濤等4研究發(fā)現(xiàn)，aspase3介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡是脂肪肝發(fā)病過(guò)程中肝細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在凋亡率最高的模型組，aspase3基因表達(dá)量最高；正常組aspase3基因表達(dá)量最低，說(shuō)明aspase3蛋白的上調(diào)，使細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)增強(qiáng)，在NAFLD的發(fā)生中可能有一定意義。經(jīng)過(guò)用藥干預(yù)，各治療組aspase3蛋白均明顯下降，細(xì)胞凋亡趨勢(shì)減弱，以消瘀化痰方高、低劑量組較為明顯，其效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。說(shuō)明消瘀化痰方可通過(guò)抑制aspase3蛋白的表達(dá)，減少肝細(xì)胞的凋亡，加速肝細(xì)胞的DNA合成及分裂增殖，以到達(dá)減輕NAFLD大鼠的肝臟脂肪變性、恢復(fù)肝臟正常功能的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1苗卉