酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測傷寒O抗體PPT

1、關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測傷寒O抗體第一張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo摘要目的：檢測傷寒O抗體一般采用肥達(dá)實(shí)驗(yàn)（直接凝集實(shí)驗(yàn)），在臨床診斷中有重要的意義。能否建立一個(gè)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中抗傷寒“O”抗體的實(shí)驗(yàn)體系，提高臨床診斷效果是本實(shí)驗(yàn)要解決的關(guān)鍵問題。第二張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：以傷寒O抗原免疫動(dòng)物，制備出抗傷寒O抗體，將后者純化，與酶連接制備成酶標(biāo)抗體，以傷寒O抗原包被酶標(biāo)板，以制備的傷寒酶標(biāo)抗體為競爭抗體，可以構(gòu)成競爭法檢測傷寒抗體的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)。摘要第三張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 摘要結(jié)果：成功建立了一個(gè)

2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測傷寒O抗體的實(shí)驗(yàn)體系結(jié)論：酶聯(lián)免疫吸附法可以檢測血清中抗傷寒“O”抗體第四張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔（1.性格溫順，一般不咬人，但其爪銳利，掙扎時(shí)易抓傷操作人員 2.與傷寒沙門菌種屬差異大，可保證產(chǎn)生抗體 3.體重大，血量多，得到的血清可保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行）實(shí)驗(yàn)試劑：飽和硫酸銨溶液 PBS透析液 辣根過氧化物酶(HRP) NaIO4溶液 2.5%乙二醇溶液 硼氫化鈉溶液 包被稀釋液 酶標(biāo)抗體 待測抗體 稀釋液 洗滌液 底物液實(shí)驗(yàn)器材：兔籠 透析膜 離心機(jī) 加樣器 酶標(biāo)板第五張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于20

3、22年6月Company Logo實(shí)驗(yàn)步驟1234制備傷寒O抗體 純化 抗體 酶與抗體的連接 ELISA競爭檢測傷寒O抗體（預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)）第六張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月制備傷寒O抗體顆粒性抗原傷寒桿菌備注第一周第一天耳緣靜脈注射0.1ml之前取血0.7-1ml，分離血清，待用第二天耳緣靜脈注射0.2ml第三天耳緣靜脈注射0.2ml第四天耳緣靜脈注射0.5ml第二周加強(qiáng)免疫：皮下注射1.0ml（兩側(cè)各0.5ml）第三周耳中央動(dòng)脈采血，分離血清第七張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月純化抗體 1份血清（5ml）+ 1份生理鹽水 + 2份飽和硫酸銨 置試管中 2000轉(zhuǎn)離心

4、20min 棄上清 1.52ml NS 溶解沉淀 透析24h 收集、標(biāo)記、冰凍 5管緩緩搖動(dòng) ,室溫2h（1.5h）鹽析法第八張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶與抗體的連接實(shí)驗(yàn)原理：NaIO4是強(qiáng)氧化劑，能將HRP的甘露糖部分（與酶活性無關(guān)的部分）的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體，反應(yīng)式如下：實(shí)驗(yàn)方法：標(biāo)記過程：1.將HRP 5mg溶于0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 緩沖液中（老師做）。2.滴入NaIO4 0.25ml,此時(shí)酶的顏色由黃變綠。4作用30min。第九張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶與抗體的連接3.加入2.5%乙二醇溶液0.5m

5、l（穩(wěn)定劑）終止反應(yīng)，室溫30min 。 4.加入待標(biāo)Ab1.52.0ml,用pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)整反應(yīng)液的pH至 9.0左右，4過夜。5.加入0.1ml硼氫化鈉，42小時(shí)。6.pH7.4 PBS液透析過夜，收集、標(biāo)記成酶標(biāo)記抗體和凍存第十張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體（一）.酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體預(yù)實(shí)驗(yàn)1.包被Ag：抗原（傷寒）用包被液稀釋，每孔加入100l，置37作用4h或4作用24h。2.洗滌：棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次1min，于吸水紙上充分拍干。3.加入樣品：每孔加入酶標(biāo)Ab及Ab各100l，放入37恒溫箱中孵育30min。（

6、如圖1）4.洗滌：同上5.加入底物液：每孔加入底物液A1滴、B1滴，避光放置約5-15min，密切觀察。6.終止反應(yīng)第十一張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體 待測酶標(biāo)原液1：51：251：125陰性對(duì)照1：251：501：1001：200（圖1）選擇每一排陰陽色差最明顯者為最佳工作濃度第十二張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體稀釋方法：1.酶標(biāo)抗體1:251200ul(牛奶）+50ul（酶標(biāo)）=1250ul1:50600ul(牛奶）+600=1200ul1:100 600ul(牛奶）+600=1200ul1:200600ul

7、(牛奶）+600=1200ul第十三張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體2.待測抗體1:5600ul(牛奶)+150ul(待測)=750ul1:25600ul(牛奶)+150ul=750ul 1:125600ul(牛奶)+150ul=750ul 第十四張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體（二）酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體正式實(shí)驗(yàn) 選取預(yù)實(shí)驗(yàn)所選定的最佳工作濃度對(duì)酶標(biāo)抗體及待測抗體進(jìn)行稀釋，驗(yàn)證該檢測方法的可行性。方法如下：1.包被 2.洗滌 3.加樣(如圖2) 4.洗滌 5.顯色 6.判斷檢出率第十五張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作

8、于2022年6月酶聯(lián)免疫競爭法檢測傷寒O抗體自己的待測Ab100ul+酶標(biāo)Ab100ul別組的待測Ab100ul+酶標(biāo)Ab100ul稀釋液100ul+酶標(biāo)Ab100ul 陽性 對(duì)照 待測1 待測2 待測3 待測4 陰性 對(duì)照?qǐng)D(2)經(jīng)洗滌顯色后,根據(jù)顏色深淺判斷檢出率,若待測組顏色更接近于陽性對(duì)照,則記為“+”，反之則記為“-”。第十六張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果討論（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陰 陽第十七張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果討論 以酶標(biāo)抗體1：100稀釋和待測抗體原液為最佳工作濃度做正式實(shí)驗(yàn)，得到以下結(jié)果，待測1“+” ,待測2“+” ,待測3“+” ,待測4“+” ;4組待測抗體均被成功檢出，檢出率100%。第十八張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果討論 （二）實(shí)驗(yàn)討論傷寒，由傷寒桿菌引起，檢測傷寒O抗體在傷寒桿菌感染的診斷中具有重要意義，采用肥達(dá)實(shí)驗(yàn)可對(duì)抗體進(jìn)行半定量檢測。但近年來發(fā)現(xiàn)，隨著輕型和亞型病人的增多，傷寒桿菌變異株增多，或發(fā)病早期大量使用抗生素，抑制傷寒沙門菌或應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素等免疫抑制劑抑制抗體的形成，肥達(dá)實(shí)驗(yàn)陽性率有下降的趨勢，難以滿足臨床要求。ELISA法檢測傷寒桿菌抗原或抗體，靈敏度好、特異性強(qiáng)、二者均達(dá)到70%第十九張，PPT共二十一頁