寄生蟲(chóng)低溫保存的研究現(xiàn)狀

1、寄生蟲(chóng)低溫保存的研究現(xiàn)狀王愛(ài)民 周?chē)?guó)燕 （上海理工大學(xué)低溫醫(yī)學(xué)與食品冷凍研究所，中國(guó) 上海 200093）摘要：低溫保存寄生蟲(chóng)可消除傳統(tǒng)保存方法的弊端，并可保持寄生蟲(chóng)原有的生物學(xué)特性。本文綜述了寄生原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)低溫保存的研究現(xiàn)狀，著重從低溫抗凍劑、降溫過(guò)程和復(fù)溫過(guò)程三個(gè)方面，探討了不同寄生蟲(chóng)低溫保存的最佳工藝，分析得出低溫抗凍劑、冷凍速度和融凍速度是影響保存損傷程度的主要因素，為寄生蟲(chóng)低溫保存研究提供理論幫助，并指出今后研究的方向。關(guān)鍵詞：寄生蟲(chóng)，低溫保存，低溫抗凍劑，降溫，復(fù)溫The Research Progress of Cryopreservation of ParasitesWANG

2、Ai-min ZHOU Guo-yan(Institute of Cryo-medicine and Food Refrigeration, Shanghai University of Science and Technology， Shanghai 200093, China ) Abstract: The cryopreservation of parasites not only can eliminate limitations, but also can maintain the original biological characteristics of parasites. I

3、n this paper, the research progress of cryopreservation of protozoa and worms parasites is summarized, of which the cryoprotectant, freezing processes and thawing processes are mainly discussed. And the conclusion is got that the most important factors of cryopreservation of parasites are cryoprotec

4、tant, freezing and thawing rates. Some key subjects of further research are pointed out. Keyword: cryopreservation, parasites, cryoprotectant, freezing processes, thawing processes寄生蟲(chóng)1是寄生在另一種動(dòng)物體內(nèi)來(lái)獲取維持其生存、發(fā)育和繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并對(duì)寄生動(dòng)物造成損害的一種生物。十九世紀(jì)二三十年代，人們開(kāi)始研究犬惡絲蟲(chóng)微絲蚴和猴瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期保存。傳統(tǒng)的寄生蟲(chóng)保存方法2,3有體外培養(yǎng)和動(dòng)物轉(zhuǎn)種，這些方法價(jià)格昂貴，

5、繁瑣，而且有一定的風(fēng)險(xiǎn)，往往容易發(fā)生遺傳漂變、人為差錯(cuò)或混淆等問(wèn)題。隨著冷凍技術(shù)的發(fā)展以及液氮的使用，寄生蟲(chóng)的低溫保存技術(shù)也發(fā)展起來(lái)。低溫保存技術(shù)不僅能消除傳統(tǒng)方法存在的弊端，而且能延長(zhǎng)存活時(shí)間，保持原有的生物學(xué)特性。低溫保存寄生蟲(chóng)可用于寄生蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活史、致病性以及寄生蟲(chóng)病的藥物篩選、免疫診斷和免疫預(yù)防，也為建立“寄生蟲(chóng)庫(kù)”提供了簡(jiǎn)便、實(shí)用而有效的方法，具有重要的使用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)意義。本文著重從寄生蟲(chóng)的種類(lèi)及低溫保存技術(shù)兩大方面闡述低溫保存寄生蟲(chóng)的最新研究進(jìn)展，并探討該領(lǐng)域今后研究的主要方向。1 寄生蟲(chóng)低溫保存的種類(lèi)近些年來(lái)，寄生蟲(chóng)的低溫保存研究主要是原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)，它們因種類(lèi)及發(fā)育階段的不

6、同所表現(xiàn)出的低溫忍耐力也不盡相同。寄生原蟲(chóng)低溫保存的研究原蟲(chóng)類(lèi)是寄生蟲(chóng)低溫保存中研究比較早的一個(gè)種類(lèi)，在20世紀(jì)70年代出現(xiàn)了許多與此有關(guān)的研究報(bào)道4。目前，有關(guān)原蟲(chóng)類(lèi)低溫保存的研究報(bào)道很多，主要有利什曼原蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等。成功保存利什曼原蟲(chóng)前鞭毛體以及感染杜氏利什曼原蟲(chóng)的地鼠組織后，學(xué)者對(duì)利什曼原蟲(chóng)的低溫保存進(jìn)行了更多的研究5。瘧原蟲(chóng)的研究早期主要集中在紅內(nèi)期和子孢子器，到20世紀(jì)70年代，成功用伯氏鼠作為載體低溫保存瘧原蟲(chóng)，隨后在90年代瘧原蟲(chóng)配子體成功保存6。這些成果為惡性瘧原蟲(chóng)的體外連續(xù)培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)，也為隨后的體外篩選、抗體疫苗的研究以及基因組的研究提供了很大的方便。之后研究者對(duì)

7、瘧原蟲(chóng)的低溫保存條件進(jìn)行了更多研究，如用血液或者動(dòng)物組織進(jìn)行低溫保存，并探討了不加抗凍劑的低溫保存的方法7。弓形蟲(chóng)的低溫保存已經(jīng)很普遍 8,9，主要研究速殖子，大多采用感染小鼠腹水加抗凍劑進(jìn)行保存。其它原蟲(chóng)類(lèi)的寄生蟲(chóng)如阿米巴原蟲(chóng)、人毛滴蟲(chóng)等的低溫保存也有研究。如Fulton10等人用甘油作抗凍劑，成功的對(duì)阿米巴滋養(yǎng)體進(jìn)行了低溫保存。寄生蠕蟲(chóng)低溫保存的研究目前，寄生蠕蟲(chóng)的低溫保存研究主要針對(duì)三個(gè)階段：蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)。其中絲蟲(chóng)、吸蟲(chóng)的研究比較全面。絲蟲(chóng)是研究比較早的品種。在20世紀(jì)60年代以前，絲蟲(chóng)的冷凍以不加任何抗凍劑為主，且多數(shù)集中在絲蟲(chóng)微絲蚴方面11,12，60年代以后對(duì)添加低溫抗凍劑進(jìn)行

8、了探索。首先使用的是DMSO，進(jìn)行冷凍保存實(shí)驗(yàn)，效果很好。70年代以后，抗凍劑等因素被廣泛考慮，并開(kāi)始研究各種類(lèi)絲蟲(chóng)微絲蚴的低溫保存13。如彭亨絲蟲(chóng)微絲蚴、馬來(lái)絲蟲(chóng)微絲蚴、多種盤(pán)尾微絲蚴、旋盤(pán)尾絲蟲(chóng)，都獲得了成功。但對(duì)于絲蟲(chóng)成蟲(chóng)的低溫保存到80年代才開(kāi)始有報(bào)道14。寄生吸蟲(chóng)的低溫保存，James15較系統(tǒng)地對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)進(jìn)行了研究。從血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的產(chǎn)生，各種抗凍劑等條件進(jìn)行了一系列的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)產(chǎn)生后，在60-90分鐘內(nèi)進(jìn)行低溫保存，生存率比較高。各種抗凍劑比較后發(fā)現(xiàn)，甲醇最好。蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)卵的低溫保存研究主要集中在圓蟲(chóng)卵、雞蛔蟲(chóng)卵、犬鉤蟲(chóng)卵等。Cruthers16等人認(rèn)為一般采用

9、-93下保存蟲(chóng)卵；沈靜德14等人采用PVP和7.5%乙二醇作為抗凍劑，采用慢速冷凍法進(jìn)行液氮保存，均獲得成功。2 寄生蟲(chóng)低溫保存的主要影響因素在寄生蟲(chóng)低溫研究中，原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)的低溫保存影響因素大致相同，主要是低溫抗凍劑、冷凍速度和融凍速度等，這些條件相互影響，如配合適當(dāng)，可收到較好的保存效果。21 低溫抗凍劑在蠕蟲(chóng)和原蟲(chóng)的低溫保存中，保護(hù)劑的選用也不盡相同。原蟲(chóng)多選用甘油、DMSO、PVP等穿透性抗凍劑，如瘧原蟲(chóng)寄生于紅細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)該考慮用滲透型抗凍劑，用的較多的是甘油、DMSO和山梨醇17,18；自由生活的卡氏棘阿米巴和福氏納格里阿米巴原蟲(chóng)以DMSO作為抗凍劑，冷凍保存獲得較好效果19。而在蠕蟲(chóng)

10、的低溫保存中，DMSO和血清較為常用。雖然多數(shù)研究者傾向于使用低溫抗凍劑，但也有少數(shù)研究者認(rèn)為低溫抗凍劑本身屬于化學(xué)藥品，對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，且研究發(fā)現(xiàn)室溫下抗凍劑的毒性20和滲透性比0時(shí)大，所以應(yīng)該在冰浴下添加抗凍劑。Yuko Miyake等21人研究了DMSO、丙二醇、甘油、聚乙烯吡咯酮、血清和蛋黃的不同濃度對(duì)寄生蟲(chóng)低溫保存的影響，發(fā)現(xiàn)效果最好的是甘油和DMSO，對(duì)其毒性的研究表明：DMSO的毒性最高，其次是丙二醇，最低的是血清和蛋黃?？箖鰟┑蜏厥褂没蛘吒渌镔|(zhì)共同使用，可減少毒性。有研究發(fā)現(xiàn)利用宿主的部分組織如肝脾等或宿主整體等方式來(lái)代替抗凍劑，同樣取得較好的保存效果。用動(dòng)物的部分組

11、織或整個(gè)小動(dòng)物來(lái)低溫保存瘧原蟲(chóng)22，并對(duì)比不加抗凍劑，研究結(jié)果顯示：被感染瘧原蟲(chóng)的小鼠肝臟和脾臟組織在無(wú)低溫保護(hù)劑的條件下，同樣可以進(jìn)行長(zhǎng)期的保存和復(fù)蘇。孫榴男等23人用一定比例的DMSO和小牛血清混合液作保護(hù)劑，對(duì)凍存1-2年的馬媾疫錐蟲(chóng)與傳代錐蟲(chóng)的形態(tài)、致病性和藥物耐藥性等方面進(jìn)行了比較，結(jié)果基本一致，蟲(chóng)體的超微結(jié)構(gòu)也無(wú)明顯差異。Bemrick24等人認(rèn)為在低溫抗凍劑中加入吐溫80或者皂土小粒，既可以增強(qiáng)抗凍劑的保護(hù)作用，又減輕了抗凍劑的毒性。2.2 降溫過(guò)程目前，寄生蟲(chóng)的低溫保存方法有快速法和慢速法?？焖俜ㄊ侵苯拥貙?biāo)本投入到致冷劑中，它適用于少數(shù)單細(xì)胞類(lèi)寄生蟲(chóng)，如瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等。Wi

12、lson25等人低溫保存諾氏瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期，研究發(fā)現(xiàn)快速冷卻更宜于保存紅細(xì)胞和瘧原蟲(chóng)環(huán)形體，且能保持瘧原蟲(chóng)的抗原特異性。慢速冷卻法應(yīng)用的比較廣泛，先慢速冷卻至中間的某一溫度，然后將其直接置入液氮。Ham26等人采用慢速冷卻法保存蟠尾絲蟲(chóng)微絲蚴，獲得較為理想的結(jié)果。崔昱27等采用慢速冷卻法低溫保存周期型馬來(lái)絲蟲(chóng)成蟲(chóng)獲得成功。慢速冷卻中常因選用的寄生蟲(chóng)不同中間溫度也有所不同。同一種寄生蟲(chóng)，即使能同時(shí)用這兩種方法保存成功，效果也有差異。竇蘭清28等人采用快速冷卻法和慢速冷卻法來(lái)對(duì)其毛圓線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)進(jìn)行低溫保存，發(fā)現(xiàn)慢速冷卻法保存的幼蟲(chóng)的存活率高。 James29等人對(duì)一些特殊品種的寄生蟲(chóng)采用了玻璃化的

13、保存方法，取得了較好的保存效果。他們通過(guò)特殊的方法對(duì)溶液進(jìn)行脫水，使溶液中的低溫保護(hù)劑的濃度增加，然后快速降溫實(shí)現(xiàn)玻璃化。目前，雖然這種方法只保存了少量特殊的寄生蟲(chóng)，但可以預(yù)測(cè)，玻璃化保存會(huì)被更廣泛的應(yīng)用到寄生蟲(chóng)的保存中去。2.3 復(fù)溫過(guò)程與降溫過(guò)程相比，復(fù)溫過(guò)程的研究顯得薄弱得多。在許多情況下，寄生蟲(chóng)在最佳冷卻速率的情況下降至低溫，然后進(jìn)行長(zhǎng)期保存，但極有可能在復(fù)溫過(guò)程中遭受損傷而死亡。復(fù)溫過(guò)程造成損傷的原因可能有多方面。如經(jīng)冷凍后膜的滲透率發(fā)生變化?？赡茉斐蓾B透率過(guò)大或者過(guò)小，甚至沒(méi)有滲透功能。有的雖然沒(méi)有變化，但在復(fù)溫過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)胞溶解。嚴(yán)格的講，正確的復(fù)溫過(guò)程是降溫過(guò)程的函數(shù)，應(yīng)針對(duì)不

14、同的降溫過(guò)程選用不同的復(fù)溫過(guò)程，但人們研究得還極少。Yuko Miyake21等人研究了寄生蟲(chóng)的復(fù)溫過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)采用快速?gòu)?fù)溫能夠保持寄生蟲(chóng)的較好的傳染性和能動(dòng)性，雖然在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中復(fù)溫速率沒(méi)有成線性關(guān)系，但這種方法值得被采用。目前比較常用的寄生蟲(chóng)復(fù)溫過(guò)程是快速解凍法解凍，整個(gè)過(guò)程控制在1分鐘之內(nèi)，即取出之后迅速浸入37-45的溫水浴中，而且溫度必須恒定，避免激烈震動(dòng)，因此具體的水浴溫度因寄生蟲(chóng)的種類(lèi)的不同而不同。3結(jié)論與展望如何長(zhǎng)期保存活的寄生蟲(chóng)，是寄生蟲(chóng)學(xué)研究的重要課題，用體外培養(yǎng)或動(dòng)物接種方法保存原蟲(chóng)，不僅耗時(shí)費(fèi)力，還可以能導(dǎo)致蟲(chóng)體存活力降低、毒力減退等生物學(xué)特性的改變，甚至出現(xiàn)才基因漂變的

15、現(xiàn)象，給寄生蟲(chóng)的研究帶來(lái)一定影響。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究低溫保存技術(shù)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)降低溫度可減緩生物新陳代謝，延長(zhǎng)存活時(shí)間，保持原生物學(xué)特性，并在多種寄生蟲(chóng)的保存試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。本文主要從寄生蟲(chóng)的保存種類(lèi)以及影響寄生蟲(chóng)低溫保存的角度出發(fā)，綜述寄生蟲(chóng)低溫保存的研究現(xiàn)狀，并進(jìn)行了比較和探討。寄生蟲(chóng)的低溫保存研究主要是原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)，它們因種類(lèi)及發(fā)育階段的不同所表現(xiàn)出的低溫忍耐力也不盡相同，所選用的低溫保存方法也有所不同。本文從低溫抗凍劑、降溫過(guò)程、復(fù)溫過(guò)程三個(gè)方面著手，闡述寄生蟲(chóng)低溫保存的最新研究狀況，討論了不同寄生蟲(chóng)低溫保存的最佳工藝，分析得出冷凍速度、融凍速度和低溫抗凍劑是影響損傷程度的主要因素。不同的

16、冷凍速度和融凍速度對(duì)寄生蟲(chóng)低溫保存的存活率也不同，而且冷凍速度和融凍速度之間也相互聯(lián)系，共同影響寄生蟲(chóng)低溫保存的效果，應(yīng)針對(duì)不同的降溫過(guò)程選用不同的復(fù)溫過(guò)程。曲莉30等人用3種不同方法對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的凍存復(fù)蘇進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)若冷凍速度選用不當(dāng)，在復(fù)溫過(guò)程中常出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。因?yàn)樵诘蜏乇４孢^(guò)程中，細(xì)胞外的水首先結(jié)冰，使未結(jié)冰溶液中的電解質(zhì)濃度升高，引起細(xì)胞溶質(zhì)損傷；此外，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)的水分也會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而導(dǎo)致細(xì)胞冰晶損傷，而復(fù)溫過(guò)程可能影響膜的滲透性。另外雖然低溫抗凍劑的使用能提高寄生蟲(chóng)低溫保存的存活率，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)低溫抗凍劑穿透能力的不

17、同及本身的毒性都會(huì)造成寄生蟲(chóng)的損傷，所以低溫抗凍劑的選擇、使用、去除及毒性是我們急需要解決的問(wèn)題。低溫生物學(xué)自上世紀(jì)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，低溫保存寄生蟲(chóng)的研究取得了可喜的進(jìn)展，但對(duì)寄生蟲(chóng)的冷凍保存的機(jī)制尚不十分清楚，而且寄生蟲(chóng)的低溫保存主要集中在原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)方面，而且缺少對(duì)寄生蟲(chóng)各個(gè)生理階段的低溫保存，所以為了建立“寄生蟲(chóng)庫(kù)”，我們還有大量的工作需要做。因此，加快基礎(chǔ)研究、尋求最佳工藝、研制新型低溫設(shè)備是當(dāng)前需要重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。參考文獻(xiàn)1 J.H.Gill, J.M.Redwin. Cryopreservation of the first-stage larvage of trich

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