時(shí)間分辨熒光免疫分析的原理

1、一、前言近百年來，“特效試劑一直是分析化學(xué)家追求的目標(biāo)。所謂“特效試劑”，就是指 的是只與一種待測物質(zhì)反應(yīng)的試劑。事實(shí)上，目前使用的所謂的“銅試劑”、“鐵 試劑”、“硝酸試劑”等等，都是“盛名之下，其實(shí)難副”的。20世紀(jì)40-50年代追 求合成特效試劑的狂熱，早已降溫。正在分析化學(xué)家心灰意冷之際，人們從免疫 學(xué)與生物化學(xué)的成就看到了這一理想的曙光：免疫系統(tǒng)簡直就是天然存在的一部 特異性試劑的合成機(jī)器?？乖c抗體之間的免疫反應(yīng)具有高度的特異性，這種識 別的專一性超過酶對底物的識別水平，抗原-抗體復(fù)合物的穩(wěn)定常數(shù)一般為109, 有些高達(dá)1010-1015，具有很高的穩(wěn)定性。免疫反應(yīng)的特點(diǎn)使得免疫分

2、析已成為 一個(gè)跨學(xué)科的新型分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于臨床體液分析、藥物分析、環(huán)境分析、 食品分析和生物化學(xué)研究，尤其在毒品的鑒定、吸毒人員的認(rèn)定和疾病的診斷方 面，發(fā)揮了重要作用。時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）是自80年代以來新發(fā)展起來的一種新型分 析技術(shù)，與其它免疫分析技術(shù)相比，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。它克服了放射性免疫分析 法（RIA）中放射性同位素帶來的污染問題；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不 穩(wěn)定的缺點(diǎn)；而且，由于TRFIA法能夠很好的消除背景熒光的干擾，使其靈敏度 比普通熒光法（FIA）高出幾個(gè)數(shù)量級。正是由于TRFIA的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，使得它成 為免疫分析中最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N分析方法。二、

3、時(shí)間分辨熒光免疫分析的原理時(shí)間分辨熒光免疫分析的原理就是使用三價(jià)稀土離子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、 Dy3+）作為示蹤物，通過這些稀土離子與具有雙功能結(jié)構(gòu)的螯合劑以及抗原形成 稀土離子-螯合劑-抗原螯合物。當(dāng)標(biāo)記抗原、待測抗原共同競爭抗體，形成免疫 復(fù)合物，由于免疫復(fù)合物中抗原抗體結(jié)合部分就含有稀土離子，當(dāng)采取一些辦法 將結(jié)合部分與游離部分分開后，利用時(shí)間分辨熒光分析儀，即可測定復(fù)合物中的 稀土離子發(fā)射的熒光強(qiáng)度，從而確定待測抗原的量。正常情況下，免疫復(fù)合物中的稀土離子自身熒光信號很微弱，若加入一種酸性增 強(qiáng)液，稀土離子從免疫復(fù)合物中解離出來，和增強(qiáng)液中的8-二酮體、三正辛基氧 化膦、

4、Triton X-100等成分形成一種微囊。后者被激發(fā)光激發(fā)后，則稀土離子可 以發(fā)出長壽命的極強(qiáng)的熒光信號，使原來微弱的熒光信號增強(qiáng)將近100萬倍。采用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光，采用了門控技術(shù)，它是使背景熒光信號降低到零以 后，再測定長壽命標(biāo)記物的熒光。三、時(shí)間分辨熒光分析的測量方法（1）解離增強(qiáng)測量法 解離增強(qiáng)測量法是解離增強(qiáng)稀土離子熒光方法，簡稱DELFIA法。通過雙功能基 團(tuán)把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗體或SA上，免疫反應(yīng)后，部分標(biāo)記物結(jié)合到 固相載體上，未結(jié)合的標(biāo)記物被洗掉。最后用低pH值的增強(qiáng)液，把Eu3+或Sm3+ 從免疫復(fù)合物中解離下來，組成Eu3+-（NTA）3.（TOPO）

5、3或Sm3+-（NTA）3.（TOPO）3新 的螯合物，使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)將近百萬倍。用Arcus型系列儀進(jìn)行液相檢測。本法 重復(fù)性好，特別適用于大、小分子活性物質(zhì)的檢測。采用DELFIA測量，靈敏度 可達(dá)10-1610-18mol的DNA量（即10pgDNA）。此法的不足之處是不能直接測 量固相樣品的熒光，需要外加增強(qiáng)液，容易受外源性Eu3+或Sm3+干擾，而影響 結(jié)果，有待改進(jìn)。（2）固相熒光測量法固相熒光法又稱為DSLFIA法。它是通過具有特殊雙功能基團(tuán)的螯合劑BCPDA， 把Eu3+或Sm3+與抗體或抗原螯合。當(dāng)抗原與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，固相免疫復(fù) 合物中Eu3+-BCPDA熒光強(qiáng)度可直接

6、測量。整個(gè)過程不用外加增強(qiáng)液，可以直接 測量固相樣品的熒光，解決了液相測量帶來易于污染和操作復(fù)雜的問題?，F(xiàn)已用 于核酸探針檢測，取得滿意進(jìn)展，國外已制成藥盒供應(yīng)。（3）直接熒光測量法直接熒光法是采用雙功能螯合劑二乙三胺五乙酸-對氨基水楊酸（DTPA-PAS）與 抗原或抗體偶聯(lián)，免疫反應(yīng)后，再加入適量的Tb3+，直接測量液相熒光強(qiáng)度。 不需要預(yù)先制備Tb3+標(biāo)記物，簡化了操作步驟，但靈敏度較低，僅為10-9mol/l。 為提高檢測靈敏度，可以引入酶放大系統(tǒng)，以SA-堿性磷酸酶水解5-氟水楊酸磷 酸酯，生成5-氟水楊酸，后者在高pH條件下，與Tb3+-EDTA-HCl形成高熒光強(qiáng) 度的復(fù)合物，可直

7、接測定。（4）均相熒光測量法均相熒光測量法是利用特殊的雙功能螯合劑W1174，將Eu3+標(biāo)記小分子活性物 質(zhì)，當(dāng)與抗體結(jié)合后，免疫復(fù)合物對Eu3+熒光信號有顯著增強(qiáng)或淬滅作用，故 在測量前不必進(jìn)行分離，就可直接測量液相中的熒光強(qiáng)度。該法省去了洗滌、分 離和加增強(qiáng)液等煩瑣的步驟，具有快速、方便等優(yōu)點(diǎn)，但不足之處是需要特殊螯 合劑。（5）協(xié)同熒光測量法協(xié)同熒光測量法是利用一些不發(fā)熒光的稀土離子，如Cd3+、Y3+、La3+、Lu3+等， 能使發(fā)熒光的稀土離子的熒光信號大大增強(qiáng)。在免疫分析體系中，pH值為6.0-8.0 時(shí)，它們的熒光強(qiáng)度最大，有利于提高檢測的靈敏度。此外，此法可以對一分樣 品中不同

8、組分含量進(jìn)行同時(shí)測量。但需要特殊的增強(qiáng)液，同時(shí)Cd3+、Y3+、La3+、 Lu3等稀土離子的純度對測量結(jié)果有明顯影響。四、時(shí)間分辨熒光免疫分析的應(yīng)用時(shí)間分辨熒光免疫分析可用來檢測生物活性物質(zhì)，特別是在生物樣品免疫分析 中，顯示出它愈來愈多的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。在內(nèi)分泌激素的檢測，腫瘤標(biāo)志物的檢測， 抗體檢測，病毒抗原分析，藥物代謝分析以及各種體內(nèi)或外源性超微量物質(zhì)的分 析中，應(yīng)用TRFIA法越來越普遍。近年來，已將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于核酸探針分析和 細(xì)胞活性分析、生物大分子分析，發(fā)展十分迅速。（1）TRFIA法在內(nèi)分泌學(xué)中的應(yīng)用內(nèi)分泌激素是一些活性小分子，它們能與適當(dāng)?shù)目贵w反應(yīng)，具有免疫反應(yīng)性，但 不能產(chǎn)生

9、抗體，不具有免疫原性，它們屬于半抗原。對這些半抗原的測定，一般 多用競爭性時(shí)間分辨熒光免疫法測定。這方面的測定主要有血清中孕酮3、雌 二醇4、睪酮5、甲狀腺激素6、前列腺素7的測定等等。（2）TRFIA在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用對一些完全抗原，它們大多是既有免疫反應(yīng)性又有免疫原性的蛋白質(zhì)類，主要包 括促甲狀腺激素8、血清胰島素9、血清癌胚抗原10-11、血清甲胎蛋白12、 乙型肝炎表面抗原13等，主要采用非競爭性TRFIA法進(jìn)行測定。（3）TRFIA法在免疫學(xué)中的應(yīng)用某些免疫細(xì)胞（如NK、LAK、T殺傷細(xì)胞等）的活性，可以用TRFIA法來檢測。如Blomberg14等用該方法測定了 NK細(xì)胞的活性；Gr

10、anberg15等用TRFIA法測 定殺傷性T淋巴細(xì)胞活性；Volgmann16等測定了 LAK細(xì)胞的活性；Maley17 用TRFIA法測定細(xì)胞介導(dǎo)的、補(bǔ)體介導(dǎo)以及抗體依賴的細(xì)胞活性；Lovgren和 Blomberg18用此法同時(shí)測定兩種靶細(xì)胞的活性；陳泮藻19等也用此法測定了 T 淋巴細(xì)胞的活性。這些測定均取得了良好的結(jié)果。（4）TRFIA法在微生物學(xué)中的應(yīng)用由于TRFIA技術(shù)具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，TRFIA法在微生物檢測和分析 中的應(yīng)用日益廣泛和深入。目前TRFIA已廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒、腦炎病毒、 流感病毒、呼吸道合胞體病毒（RSV）、副粘病毒、風(fēng)疹病毒、馬鈴薯病毒、輪 狀病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV）、出血熱病毒和梅毒螺旋體的抗原抗體以及 某些細(xì)菌和寄生蟲抗體的檢測2。最近,潘利華20等用TRFIA法進(jìn)行了人血清中 丙型肝炎病毒抗體（Anti-HCV）的檢測，效果明顯高于酶聯(lián)免疫法。五、展望時(shí)間分辨熒光免疫分析具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、所用試劑有良好的穩(wěn)定性、檢 測限較寬、