流感病毒核酸檢測作業(yè)指導書

1、流感病毒核酸檢測作業(yè)指導書1 適用范圍適用于鼻拭子、咽拭子、漱口液、鼻腔沖洗液、鼻腔吸取物、氣管吸取物等樣品中流感病毒的核酸PCR檢測。2 原理基于PCR原理進行的核酸檢測。3 儀器設備3.1 QIACube工作站3.2 ABI7500熒光定量PCR儀器3.3 核酸電泳儀3.4 離心機3.5 -20冰箱、-70冰箱、28冰箱3.6移液器（1-10L，10-100L，100-1000L）4 試劑耗材4.1 QIAGEN核酸抽提試劑盒4.2 PCR試劑盒4.3 不同規(guī)格移液槍頭4.4 1.5 mL Eppendorf 離心管5、操作步驟5.1 核酸提取5.1.1 使用QIAGEN手工抽提試劑盒進行

2、核酸抽提5.1.1.1 試劑準備Carrier RNA試劑的準備：將310L Buffer AVE加入到1管凍干的Carrier RNA（310g）中，混合均勻，徹底溶解Carrier RNA；將溶解的Carrier RNA分裝34小管，于-20冰箱保存。臨用時根據(jù)具體樣品量進行Buffer AVL工作液的配置。每管Carrier RNA反復凍融不得超過3次。Buffer AVL工作液的配置：Buffer AVL原液保存于正常室溫條件下，使用前觀察有無結晶。若有，可置于80溫度下少于5min快速溶解后使用。根據(jù)下列公式計算各成分含量進行Buffer AVL工作液的配置。 n 0.56mL =

3、y mL； y mL 10L/mL = z L n表示本次試驗所要抽提的總樣品數(shù)，包括空白陰陽性對照數(shù)；y 表示計算所得要使用的Buffer AVL工作原液；z 表示計算所得要使用的含Carrier RNA的Buffer AVE（Carrier RNA-AVE）的量；下表列舉出1-12個樣品Buffer AVL工作液配制所要使用的Buffer AVL原液與Carrier RNA-AVE的量。樣品數(shù)量Buffer AVL原液（mL）Carrier RNA-AVE（L）樣品數(shù)量Buffer AVL原液（mL）Carrier RNA-AVE（L）10.565.673.9239.221.1211.28

4、4.4844.831.6816.895.0450.442.2422.4105.6056.052.8028.0116.1661.663.3633.6126.7267.2含Carrier RNA的Buffer AVL工作液4保存48小時有效，使用前置37水浴讓結晶溶解，并混勻。Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室溫保存）產(chǎn)品號規(guī)格（人份、盒）AW1加入量96100%酒精加入量最終體積511045019mL25mL44mLBuffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室溫保存）產(chǎn)品號規(guī)格（人份、盒）AW1加入量96100%酒精加入量最終體積511045013mL30m

5、L43mL說明：上述各表是根據(jù)目前所使用試劑配制所需的各成分含量，當試劑改進后需根據(jù)新的試劑說明書進行試劑的配制。5.1.1.2核酸抽提5.1.1.2.1取1.5mL離心管，加入560L Buffer AVL工作液；5.1.1.2.2分別加入140L標本、陰性對照、臨界陽性對照、強陽性對照，渦旋振蕩混勻15秒；5.1.1.2.3 室溫放置10分鐘，瞬間離心；5.1.1.2.4 加入560L濃度為100%乙醇，渦旋振蕩混勻15秒，瞬間離心；5.1.1.2.5 取630L上述液體加入帶有2 mL廢液離心管的QIAamp離心柱，8000rmp離心1分鐘；棄去濾液，換一個干凈的廢液收集管；5.1.1.

6、2.6 重復2.5；5.1.1.2.7 打開QIAamp離心柱，加入500L Buffer AW1工作液；2.8 8000rmp離心1分鐘，棄去濾液；5.1.1.2.9打開QIAamp離心柱，加入500L Buffer AW2工作液，14000rmp離心3分鐘，棄去濾液；5.1.1.2.10 將QIAamp離心柱放入一個2mL廢液收集管，14000rmp離心1分鐘；5.1.1.2.11 將QIAamp離心柱放入一個1.5mL離心管，打開QIAamp離心柱，加入平衡至室溫的AVE洗脫液60L，室溫放置1分鐘，8000rmp離心1分鐘。離心后的液體即為抽提的RNA；5.1.1.2.12 在離心管上

7、標記編號，包括樣品編號、樣品性質(zhì)、抽提日期；5.1.1.2.13 標記好后置-70冰箱保存待用。5.1.2 使用QIACube工作站進行核酸抽提5.1.2.1試劑準備Carrier RNA試劑的準備：將310L Buffer AVE加入到1管凍干的Carrier RNA（310g）中，混合均勻，徹底溶解Carrier RNA；將溶解的Carrier RNA分裝34小管，于-20冰箱保存。臨用時根據(jù)具體樣品量進行Buffer AVE工作液的配置。每管Carrier RNA反復凍融不得超過3次。Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室溫保存）產(chǎn)品號規(guī)格（人份、盒）AW1加入量96

8、100%酒精加入量最終體積511045019mL25mL44mLBuffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室溫保存）產(chǎn)品號規(guī)格（人份、盒）AW1加入量96100%酒精加入量最終體積511045013mL30mL43mL需要注意的是，使用QIACube工作站進行核酸抽提，Buffer AVL工作液使用原液，這是與QIAGEN手工抽提試劑盒進行核酸抽提時試劑配制的不同之處。下表列出了2-12個樣品（不能進行1或11個樣品抽提）進行核酸抽提時部分試劑的配制量。樣品數(shù)量Buffer AVE（L）Diluted carrier RNA（L）2256125（28 carrier RNA +

9、97 Buffer AVE）3364150（33.6 carrier RNA + 116.4 Buffer AVE）4472175（39.2 carrier RNA + 135.8 Buffer AVE）5580200（44.8 carrier RNA + 155.2 Buffer AVE）6688225（50.4 carrier RNA + 174.6 Buffer AVE）7796250（56 carrier RNA + 194 Buffer AVE）8904275（61.6 carrier RNA + 213.4 Buffer AVE）91012300（67.2 carrier RNA

10、+ 232.8 Buffer AVE）101120325（72.8 carrier RNA + 252.2 Buffer AVE）121336375（84 carrier RNA + 291 Buffer AVE）說明：上述各表是根據(jù)目前所使用試劑配制所需的各成分含量，當試劑改進后需根據(jù)新的試劑說明書進行試劑的配制。5.1.2.2 試劑、耗材等的放置5.1.2.2.1 各試劑的安放根據(jù)儀器說明書的要求準備好試劑；5.1.2.2.2 硅膠膜過濾柱及1.5mL Eppendorf管的安放 根據(jù)儀器說明書的要求準備好過濾柱與樣品收集管；5.1.2.2.3 樣品的安放根據(jù)儀器說明書的要求準備好樣品；5

11、.1.2.2.4 離心吊籃的安放根據(jù)儀器說明書的要求在指定位置安放好離心吊籃。5.1.2.3 程序運行根據(jù)儀器設備的液晶顯示面板，選擇RNA核酸抽提，抽提過程中不得隨意打開儀器蓋子，否則程序運行會終止。如意外情況導致儀器設備程序運行被迫終止，可從終止時的步驟開始，繼續(xù)根據(jù)手工試劑盒的抽提方法進行核酸抽提。5.2 基因擴增5.2.1 Real-time PCR5.2.1.1 使用試劑盒QIAGEN Quantitect RT-PCR CAT No.2044435.2.1.2 反應體系Rnase free water2Master MixRT-MixForwardReverseProbeRNA模板總計5.5L12.5L0.25L0.5L0.5L0.75L5L25L5.2.1.3 循環(huán)參數(shù)60 5min50 30min95 15min95 15s 55 30s 7230s72 5min1114515.2.2 RT-PCR5.2.2.1 反應體系Rnase free water5RT-PCRBuffer10mM dNTP MixtureEnzyme MixRnase Inhibitor上游引物下游引物總計10.9L5L1L1L0.1L1L1L20L5.2.2.2 循環(huán)