生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建

1、生物制藥技術(shù)2016-3-71生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建生物制藥技術(shù)（含實驗）課程教學大綱教學內(nèi)容理論課學時 緒論1 基因與工程細胞的構(gòu)建3 工程細胞的發(fā)酵培養(yǎng)與蛋白表達2 重組蛋白的分離純化2 生物制藥的制劑研究1 生物制藥的質(zhì)量研究與分析技術(shù)4 生物制藥的中試研究2 生物制藥的穩(wěn)定性研究1 生物制藥的主要藥效學研究1 生物制藥的藥代動力學研究1教學內(nèi)容理論課學時小課討論學時 生物制藥的安全性評價3 第一次PBL生物制藥立項 2 抗體藥物3 基因治療與基因藥物2 腫瘤的細胞免疫治療3 第二次PBL腫瘤的治療 2 個體化醫(yī)學診療2 生物制藥的知識產(chǎn)權(quán)問題1 生物制藥的藥品注冊2 第三次PBL生物制

2、藥申報 22生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建生物制藥研發(fā)的基本流程基因構(gòu)建發(fā)酵培養(yǎng)分離純化制劑研究質(zhì)量研究中 試放 大穩(wěn)定性研 究藥效學研 究安全藥理研 究臨床申報藥學(實驗室)藥學(中試)藥理學臨床試驗3生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.2 工程細胞的發(fā)酵培養(yǎng)與蛋白表達2.3 重組蛋白的分離純化2.4 生物制藥的制劑研究2.5 生物制藥的質(zhì)量研究與分析技術(shù)2.6 生物制藥的中試研究2.7 生物制藥的穩(wěn)定性研究第二章 重組蛋白藥物的藥學概論原核細胞真核細胞4生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1.1 基本概念2.1.2 質(zhì)粒、載體2.1.3 工程細胞與細胞庫2.1.4 表達方式選擇2.1.5 基

3、因構(gòu)建與誘導表達2.1.6 實例2.1 基因與工程細胞構(gòu)建第二章 重組蛋白藥物的藥學概論5生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細胞構(gòu)建基因重組分子水平、提取、連接、轉(zhuǎn)染、復(fù)制、表達別稱基因工程、DNA重組、遺傳工程、基因操作、克隆工程細胞的三要素基因載體宿主細胞2.1.1 基本概念6生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建基因一段具有蛋白結(jié)構(gòu)編碼的核酸序列載體質(zhì)粒、噬菌體、病毒限制性內(nèi)切酶、連接酶抗生素抗性基因Kan、Neo、Tet、Amp、Str宿主細胞細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.1 基本概念7生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建組建表達載體條件強啟動子兩側(cè)的調(diào)控序列選擇標記正確

4、的讀碼框架合適的核糖體結(jié)合位點（SD序列）SD序列與起始密碼子ATG之間合適的距離被翻譯的蛋白性質(zhì)與穩(wěn)定性合適的宿主細胞2.1 基因與工程細胞構(gòu)建SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。SD序列在細菌mRNA起始密碼子AUG上游7-12個核苷酸處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細菌16S rRNA3端識別，幫助從起始AUG處開始翻譯2.1.1 基本概念8生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1.2 質(zhì)粒、載體2.1 基因與工程細胞構(gòu)建9生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細胞構(gòu)建10生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細胞構(gòu)建11生物制藥

5、技術(shù)2基因構(gòu)建克 隆鑒 定宿主細胞細胞篩選細胞庫合成、分離、RT-PCR優(yōu)化、測序抗性基因、限制性內(nèi)切酶位點宿主與產(chǎn)品的相關(guān)性表達水平、產(chǎn)品鑒定三級細胞庫、遺傳穩(wěn)定性載 體2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.3 工程細胞與細胞庫12生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建原始種子庫主種子庫工作種子庫2.1 基因與工程細胞構(gòu)建13生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建調(diào)控調(diào)控生物遺傳中心法則DNA RNA Protein2.1 基因與工程細胞構(gòu)建14生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Primary Structure The sequence of amino acids on the polypeptide chainSecond

6、ary Structure Conformation of the polypeptide chain (3D structure)Tertiary Structure Three Dimensional Structure (Folding) of the proteinQuaternary Structure Complexation with other proteins (Similar or dissimilar structures)2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.4 表達方式選擇15生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建依賴于制備過程的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Prokaryotic cells Easier

7、 to make Cheaper to produce Improper folding of protein No glycosylation No Secretion Eukaryotic cells Can properly fold the protein Glycosylate-(maybe differently) Harder to clone Harder to maintain in cell culture May harbor viruses Lower yields Higher expense2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.4 表達方式選擇16生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建

8、2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達2.1 基因與工程細胞構(gòu)建17生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達18生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建Soluble Inclusion BodySecreting2.1 基因與工程細胞構(gòu)建原核細胞表達系統(tǒng)2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達19生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建優(yōu)點突出正確指導蛋白質(zhì)正確折疊提供糖基化等多種翻譯后加工在新基因發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中起極為重要的作用生產(chǎn)階段系統(tǒng)表達水平達到7g/L生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)達國家新藥研發(fā)中均選擇哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1 基因與工程細胞構(gòu)建哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達20生

9、物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建正常細胞生長特性錨地依賴性血清依賴性接觸抑制性形態(tài)依賴性體外培養(yǎng)正常細胞改變某些特征，越過生理臨界點，繼續(xù)無限制分裂細胞系形成2.1 基因與工程細胞構(gòu)建哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達21生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建哺乳動物細胞表達系統(tǒng)受體細胞條件細胞系特征喪失細胞接觸抑制和錨地依賴性遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代不丟失合適的標記便于篩選與維持生長快且齊分裂周期短，生長均一安全性不合成、分泌致病物質(zhì)，不致癌以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞必須條件2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達22生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建遺傳標記遺傳標記編碼產(chǎn)物篩

10、選藥物作用機理APH-氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶G418APH滅活G418DHFR二氫葉酸還原酶氨甲喋呤DHFR變體抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤TK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達23生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建常用宿主細胞 商業(yè)化CHO中國倉鼠卵巢細胞系BHK小倉鼠腎細胞系COS非洲綠猴腎成纖維細胞系NSO小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0小鼠骨髓瘤細胞系HEK293人胚腎細胞

11、系NIH313鼠成纖維細胞系因穩(wěn)定性與糖基化不同，根據(jù)表達目的蛋白選擇適當細胞系哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達24生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建真核表達載體必要原件高活性啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、有效mRNA翻譯信號復(fù)制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位點標志基因內(nèi)含子內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1 基因與工程細胞構(gòu)建 一般真核mRNA的翻譯都需要5帽子來介導核糖體結(jié)合，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5端具有一段較短的RNA序列（約150-250bp），這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導核糖體與

12、RNA結(jié)合，起始蛋白質(zhì)翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內(nèi)部核糖體進入位點序列（Internal ribosome entry site, IRES）2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達25生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建誘導的方式IPTG/乳糖低溫pH低磷表達檢測方式表達標志物電泳GFP遺傳穩(wěn)定性基因穩(wěn)定性瓊脂糖電泳、指紋圖譜、PCR、測序表達穩(wěn)定性表達標志物、活性四環(huán)素蛻皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達26生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建高效表達外源蛋白的基本原理通過強化基因擴增高效表達外源基因DHFR-MTX高效表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)2.1 基因與工程細胞

13、構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導表達27生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑第一個重組哺乳動物細胞規(guī)?；a(chǎn)的溶栓藥物人組織纖溶酶原激活劑(tPA)目前市場上銷售的阿替普酶(tPA)采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達，受體細胞為CHO系統(tǒng)人tPA也可由大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白折疊效率低2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.6 實例28生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.6 實例29生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建代表藥物優(yōu)點缺點第一代鏈激酶（SK）尿激酶（UK）溶栓能力強缺乏特異性導致出血過敏反應(yīng)第二代組織型纖溶酶原激活劑（tPA）具有溶栓特異性副作用較少半衰期短需大量注射第三代瑞替普酶（rPA）蘭替普酶（NPA）溶栓快速治療效率高半衰期長生產(chǎn)工藝復(fù)雜第四代PAI-1 抑制劑可以口服給藥半衰期長價格低廉仍處于試驗階段未開發(fā)用于臨床組織纖溶酶原激活劑2.1 基因與工程細胞構(gòu)建2.1.6 實例30生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建tPArPA 527個氨基酸 分子量65kD缺失突變 355個氨基酸 分子量39kDKringle、絲氨酸蛋白酶區(qū)Finger區(qū)、Kringle、Kringle、EGF區(qū)、絲氨酸蛋白酶區(qū)2.1 基因與工程細胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑2.1.6 實例31生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑2.