實驗七血清蛋白醋纖薄膜電泳

1、動 物 生 物 化 學 實 驗實驗七 血清蛋白醋纖薄膜電泳一、實驗目的1. 學習電泳的基本原理2. 掌握血清蛋白醋纖薄膜電泳的原理及操作技能。二、實驗原理1. 電泳的基本原理 帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳，不同物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)及顆粒大小、形狀不同，因而在一定的電場中，它們移動方向和移動速度也不同，故此可使它們分離。 在電場中，顆粒移動速度以泳動度（或遷移率）表示，泳動度是指帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度，可用下式表示：式中： 泳動度cm2/(V.S) R顆粒泳動速度（cm/s） E電場強度（v/cm） d顆粒移動距離（cm） L支持物有效長度（cm）

2、 V電泳實際電壓 t電泳時間(s) 通過測定V、t、L、d、即可算出泳動度。 在電場中，推動帶電粒子運動的力（F）等于粒子所帶凈電荷量（q）與電場強度（E）的乘積。 FqE=qV/d 另外，帶電粒子的前移還要受到介質(zhì)阻力（ f ）的影響，對于一個球形質(zhì)點，服從Stoke定律，即： f 6 r （r為質(zhì)點半徑，為介質(zhì)粘滯系數(shù)，為質(zhì)點移動速度） 當質(zhì)點在電場中作穩(wěn)定運動時： F f 即：qE 6 r V = qE /6r 遷移率u： 單位電場強度下的電泳速度， 粒子的遷移率在一定條件下決定于粒子本身的性質(zhì)即其所帶電荷及大小和形狀。uv/E=q/6r 影響電泳因素(1) 待分離分子的性質(zhì) ： 包括帶

3、電粒子所帶的電荷、分子大小和形狀。 分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 (2) 電場強度： 電場強度指每1cm距離的電壓降。電場強度越高，帶電顆粒泳動速度越快。 一般E為210V/cm，V為100 500V，為常壓電泳，電泳時間從幾十分鐘幾十小時，常用分離大分子。 E為20200V/cm，為高壓電泳，電泳時間幾分鐘幾小時，多用于分離小分子物質(zhì)。(3) 溶液PH： PH影響帶電顆粒的解離，也即決定了顆粒所帶凈電荷的多少。對兩性電解質(zhì)，PH偏離PI越遠，帶電荷越多、泳動速度越快，PH=PI，其凈電荷為零，不移動。(4) 離子強度： 溶液離子強度越高、增加了電極緩沖

4、液的粘稠度，顆粒泳動速度越慢。一般離子強度為0.020.2較適宜。(5) 電滲： 在電場中，液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲。電滲將改變顆粒在電場中的泳動速度。 例如：在紙電泳中，由于濾紙纖維素上帶有一定量的負電荷，而使與紙相接觸的水分子感應而帶一些正電荷。水分子便向負極移動并帶動溶液中的顆粒一起向負極移動。若顆粒本來向負極移動，則其表觀泳動速度將比其本來的泳動速度快；若顆粒原來向正極移動，則其表觀泳動速度慢于其本來的泳動速度；凈電荷為零的顆粒也會隨水向負極移動。電泳的種類按支持介質(zhì)的不同可分為： 紙電泳（Paper electrophorisis） 醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose

5、Acetate electrophoresis） 瓊脂凝膠電泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。 按支持介質(zhì)形狀不同可分為： 薄層電泳 ； 板電泳 ； 柱電泳 2. 血清蛋白醋纖薄膜電泳原理 血清中各蛋白質(zhì)的等電點不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質(zhì)均帶負電，在電場中都向陽極移動。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶負電荷多少及分子大小不同，所以在電場中向陽極泳動速度也不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷

6、多者，泳動速度快；反之，則泳動速度慢。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、 -球蛋白和-球蛋白五條區(qū)帶，經(jīng)染色可顯示各蛋白條帶。+白蛋白(A)12三、實驗試劑及器材1.試劑 (1) 巴比妥巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06): 稱取巴比妥1.66克和巴比妥鈉12.36克，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。 (2) 染色液: 稱取氨基黑10B0.5g，分別加入蒸餾水40ml，甲醇50ml和冰醋酸10ml，混勻。 (3) 漂洗液: 分別量取95%乙醇45ml、冰醋酸5ml和蒸餾水50ml，混勻。2. 器材 儀器：電泳儀、電

7、泳槽 材料：醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、點樣器四、實驗操作1薄膜的準備： 取醋纖薄膜(2厘米*8厘米) 置于巴比妥緩沖液中浸泡，待充分浸透(即膜條無白斑時)后取出，用潔凈濾紙輕輕吸去表面的多余緩沖液。2點樣： 吸取少量血清均勻涂抹在點樣器的鋼口，隨后將鋼口垂直“印”在醋纖薄膜的粗糙面距一端2cm處，待血清滲入膜后移開點樣器。 點樣應注意：要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。3. 電泳： 將已點樣的薄膜加樣面朝下，加樣端置于陰極端，平整地貼于電泳槽的支架上拉直。支架上事先放置好兩端浸入緩沖液的用四層濾紙條作的“濾紙橋”(如圖2)。通電進行電泳。一般電壓為120160伏，電流約0.40.6毫安厘米，通電時間4050分鐘，待電泳區(qū)帶展開約3.5厘米時斷電。4. 染色: 小心取出薄膜，直接浸于氨基黑染色劑中510分鐘(以清蛋白區(qū)帶染透為止)。然后在漂洗液中連續(xù)浸洗數(shù)次，使薄膜底色漂凈，即得五條蛋白色帶。從陽極端起依次