標準菌種確認標準操作規(guī)程

1、標準菌種確認標準操作規(guī)程一目的建立標準菌種確認標準操作規(guī)程，以減少菌種污染和生長特性的改變，保證實驗結果的可靠性和準確性。二范圍本規(guī)程適用于質量控制實驗室所用標準儲備菌株。三內容1.1 試驗菌株大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC(B)44102金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC(B)26003枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)CMCC(B)63501白色念珠菌(Candidaalbicans)CMCC(F)64941黑曲霉(Aspergillusniger)CMCC(F)98003銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugin

2、osa)CMCC(B)10104生抱梭菌(Clostridiumsporogenes)CMCC(F)980011.1.1 標準菌株1.1.1.1 標準菌株應來自認可的國內或國外菌種收藏機構。1.1.1.2 標準菌株經過復活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，即為標準儲備菌株。1.1.1.3 標準儲備菌株應進行純度和特性確認。1.1.2 工作菌株1.121 標準儲備菌株可用于制備每兩個月或定期轉種的工作菌株。1.122 工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5代(從菌種收藏機構獲得的標準菌株為第0代)，以防止過度的傳代增加表型變化的風險。因此必要時，應對工作菌株的純度和特性進行確認。1.2 菌種確認試驗的

3、主要內容1.2.1 菌種的純度確認1.2.1.1 純度檢測：是指通過適當的方法檢測菌種是否為純培養(yǎng)物。1.2.1.2 試驗內容 菌落形態(tài)：在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線，適宜培養(yǎng)后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測是否重復出現相同特征。 鏡檢特征：對數生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應應呈現一致性；細胞形狀、大小、莢膜、芽抱等特征應相似。1.2.2 菌種的特性確認122.1 生化試驗：各種微生物具有各自的獨特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所參與的物質分解和合成代謝的產物也不同，這些代謝

4、產物又具有不同的生化特征。根據此特征，利用生物化學方法來鑒定不同的微生物的試驗即為微生物的生化試驗。1.3菌種的確定方法用無菌接種環(huán)粘取培養(yǎng)物，在相應的培養(yǎng)基平板上劃線分離單個菌落，并在適宜條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取單一純菌落，進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及菌形。再做生化試驗或使用菌種鑒定系統(tǒng)進一步鑒定菌種。1.3.1 大腸埃希菌的確認131.1 菌落形態(tài)1.3.1.1.1 取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經35C培養(yǎng)1824h后，形成菌膜，管底有粘液狀沉淀，培養(yǎng)物有糞臭味。1.3.1.1.2 取上述培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍瓊脂（EMB瓊脂平板和麥康

5、凱瓊脂平板上，35E培養(yǎng)1824h后，觀察結果。 曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常有金屬光澤。 麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)呈鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。1.3.1.2 革蘭染色、鏡檢1.3.1.2.1 革蘭染色 以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫，再通過火焰23次干燥使固定。 滴加結晶紫染液，染色1min，水洗。 滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。 滴加95%乙醇，脫色

6、2030s，至流出液無色，水洗。 滴加沙黃染液，復染1min，待干后，鏡檢。1.3.1.2.2 染色結果應是：革蘭陽性菌呈藍紫色：革蘭陰性菌呈紅色。1.3.1.2.3 鏡檢結果應是：兩端鈍圓的短小直桿菌，單個或成對，革蘭陰性，無芽抱，多有鞭毛，以周身鞭毛運動或不運動，許多菌株有莢膜和微莢膜。1.3.1.3 生化試驗1.3.1.3.1 靛基質試驗（I）：取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48h，沿管壁加入靛基質試液數滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。13132 甲基紅試驗（M:取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48

7、7;2h，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液23滴（約1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。13133 乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P）:取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48土2h，于2ml培養(yǎng)液中加入a-萘酚乙醇試液1ml,混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4h（通常在30min）內出現紅色應判為陽性，無紅色反應為陰性。1.3.1.3.4 枸櫞酸鹽利用試驗（C）:取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2-4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生成，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變、無菌苔生長為

8、陰性。1.3.1.3.5 乳糖發(fā)酵試驗：取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24-48h，觀察產酸（指示劑為酸性品紅者為紅色：指示劑為溴麝香草酚藍者為黃色），產氣（小倒管內有氣泡，氣泡無論大小都是產氣）。1.3.2 金黃色葡萄球菌的確認1.3.2.1 菌落形態(tài)1.3.2.1.1 取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經35C培養(yǎng)1824h后，呈均勻渾濁生長，繁殖較多時易產生沉淀，沉淀易被搖散。1.3.2.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板和卵黃氯化鈉瓊脂平板上培養(yǎng)2427h觀察結果。 甘露醇氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落

9、直徑0.7-1mm= 卵黃氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1-2mm1.3.2.2 革蘭染色、鏡檢1.3.2.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法5.3.1.2）1.3.2.2.2 鏡檢結果：為革蘭陽性球菌，菌體呈球形或略呈橢圓形，菌體較小，菌體大小不一。無芽抱，一般不產生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個、成雙或短鏈狀排列。1.3.2.3 生化試驗1.3.2.3.1 血漿凝固酶試驗試管法：取無菌試管（10mM10mm2支，各加入血漿和0.9%無菌氯化鈉溶液（1:1）0.5ml，1支加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml作為陽性對照：另一支加入無

10、菌營養(yǎng)肉湯0.5ml作為陰性對照。兩管同時置37C水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3h后開始檢查，以后每隔適當時間觀察一次，直至24h。檢查時，輕輕將試管傾斜（動作勿大），仔細觀察。 陽性對照管：血漿和無菌水混合液加金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，在3h后開始觀察直至24h。結果：血漿凝固。 陰性對照管：血漿和無菌水混合液加稀釋液，在3h后開始觀察直至24h0結果：血漿流動自如。1.3.3 枯草芽抱桿菌的確認1.3.3.1 菌落形態(tài)1.3.3.1.1 取枯草芽抱桿菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經35T培養(yǎng)1824h后，呈渾濁生長。1.3.3.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)2427h觀察結

11、果：菌落為灰色、干燥、皺縮、無典型卷發(fā)狀。1.3.3.2 革蘭染色、鏡檢1.3.3.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法5.3.1.2）1.3.3.2.2 鏡檢結果：革蘭陽性芽抱桿菌芽抱為橢圓到柱狀，位於菌體中央或稍偏，芽抱形成后菌體不膨大。1.3.4 白色念珠菌的確認1.3.4.1 菌落形態(tài)1.3.4.1.1 取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，經35C培養(yǎng)2448h后，呈渾濁生長。1.3.4.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，經3035E培養(yǎng)2448h（必要時延長至72小時）觀察結果：呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色

12、變深、質地變硬或有皺摺。1.3.4.1.3 取上述（5.3.4.1.2）培養(yǎng)物接種至白色念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，經3035C培養(yǎng)2448h（必要時延長至72小時）觀察結果：平板上為綠色或翠綠色的菌落生長。1.3.4.2革蘭染色、鏡檢及芽管試驗取上述（5.3.4.1.3）培養(yǎng)物接種至1%K山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448h。取培養(yǎng)物進行染色，鏡檢及芽管試驗。1.3.4.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法5.3.1.2）1.3.4.2.2 芽管試驗：挑取1%K山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內，置3537C培養(yǎng)13h,置顯微鏡

13、下觀察，可見到由抱子長出短小芽管。13423鏡檢結果：革蘭陽性芽抱桿菌芽抱為厚膜抱子、菌絲、芽管。135黑曲霉菌的確認135.1 鏡檢：可見抱子，菌絲。1.3.6 銅綠假單胞菌的確認1.3.6.1 取銅綠假單胞菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經35C培養(yǎng)1824h后，液面可形成菌膜，細菌在深層發(fā)育不良，呈微渾濁或透明狀，菌液上層為藍綠色。1.3.6.1.1 取上述培養(yǎng)物接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h后,觀察結果：呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。1.3.6.2 革蘭染色、鏡檢1.3.6.2.1 革蘭染色(見大腸埃希菌檢查法5.3.1.

14、2)13622鏡檢結果：銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽抱桿菌。單個，成對或成短鏈排列。1.3.6.3 氧化酶試驗取潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻璃棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽抱桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單抱菌。否則，應進行綠儂菌素試驗。1.3.6.4綠儂菌素(Pyocyanin)試驗取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時，加三氯甲烷35ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol

15、/L鹽酸試液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠儂菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDF瓊脂培養(yǎng)基斜面同法做陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠儂菌素試驗陽性，判斷供試品檢出銅綠假單胞菌。上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠儂菌素試驗陰性，應繼續(xù)進行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。1.3.7 生抱梭菌的確認1.3.7.1 取生抱梭菌新鮮培養(yǎng)物2份，其中1份置80C保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接后處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中。置厭氧條件下培養(yǎng)48小時。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分

16、別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)4872小時。若平板上有菌落生長，應選23個菌落分別進行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。137.2 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法531.2）137.3 過氧化氫酶試驗取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽抱，過氧化氫酶試驗陰性，判斷供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。1.3.8 溶血性鏈球菌的確認138.1 把凍干菌種管、滅菌滴管、培養(yǎng)皿、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，移入微生物實驗室的超凈工作臺上，待用。1.3.8.2 將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌培