限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基

1、寡核苷酸近末端位點(diǎn)的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 為了解不同內(nèi)切酶對識別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位點(diǎn)很接近時），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點(diǎn)兩端至少加上6個保護(hù)堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A260單位的寡核苷酸。取1 µg已標(biāo)記了的寡核苷酸與2

2、0單位的內(nèi)切酶，在20°C條件下分別反應(yīng)2小時和20小時。反應(yīng)緩沖液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及適量的NaCl或KCl（視酶的具體要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核苷酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。DNA合成，新鏈的延伸方向是53因此，需要在5端加上酶切位點(diǎn),因?yàn)閮?nèi)切酶除了有特異的識別位點(diǎn)之外，還需多幾個無需特異性的堿基提供一個platform讓它可以結(jié)合上去，否則會掉下來. 引物的結(jié)構(gòu)就是（53）：保

3、護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+原來的引物序列首先要看目的基因中是否含有該酶切位點(diǎn)，只有沒有的才可以選(小蝦米酶切位點(diǎn)分析)。其次，如果需要做表達(dá)，需要考慮起始密碼子，防止移碼突變酶寡核苷酸序列鏈長切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 >90 >900 >90 >90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 12>90 >90 >90

4、>90 >90 >90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 >90 >90>90 >90 >90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 >90 >9025 >90 >90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 >90 >90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0

5、>90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 >90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 >90 500 0 >90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >

6、90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 >90 >900 >90 >90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde

7、 ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220 0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGG

8、CCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 >90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 >90>90 >90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 >90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 >90Pst IGCTGCAGC TGCACTG

9、CAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 >90 >90 00 10 >90 >90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 >90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTT

10、GGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 >9010 10 50 >90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 0>90 >90 50 50Sph IGGCATGCC CAT

11、GCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 >90 75 750 >90 >90 >90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TC