手性藥物的酶促合成

1、Enzymatic Synthesis and Enzymatic resolution Enzymatic Synthesis and Enzymatic resolution Enzymatic Synthesis and Enzymatic resolution of Chiral Drugsof Chiral Drugsof Chiral Drugs第四章手性藥物的手性藥物的酶促合成與酶促拆分酶促合成與酶促拆分2006.3本章內(nèi)容本章內(nèi)容1 手性藥物概述手性藥物概述2 手性藥物的生物催化合成手性藥物的生物催化合成3 手性藥物的酶促拆分手性藥物的酶促拆分4 本章總結(jié)本章總結(jié)1 手性藥物概

2、述手性藥物概述 手性：手性：英文名英文名chiralitychirality，源為希臘文，源為希臘文cheircheir，手或，手或handednesshandedness，是用來表達化合物分子結(jié)構(gòu)不對稱的術(shù)語。人的手是不對稱的，是用來表達化合物分子結(jié)構(gòu)不對稱的術(shù)語。人的手是不對稱的，左手和右手相互不能疊和，彼此是實物和鏡像的關(guān)系。這種關(guān)系左手和右手相互不能疊和，彼此是實物和鏡像的關(guān)系。這種關(guān)系在化學(xué)中稱為在化學(xué)中稱為“對映關(guān)系對映關(guān)系”。具有對映關(guān)系的兩個物體互為。具有對映關(guān)系的兩個物體互為“對對映體映體”。1.1 手性與手性藥物手性與手性藥物2001年10月10日瑞典皇家科學(xué)院在斯德哥爾摩

3、宣布：一半授予美國科學(xué)家William S.Knowles和日本科學(xué)家野依良治另一半授予美國科學(xué)家K.Barry Sharpless2001年諾貝爾獎 三位獲獎科學(xué)家的貢獻就在于他們找到了立體選擇性合成的方法和催化劑，可以高效快速地合成一種手性分子而不生成另一種，這為開發(fā)具有新特性的分子和物質(zhì)開創(chuàng)了一個全新的領(lǐng)域。目前人們已根據(jù)他們的研究成果研制出了抗生素、消炎藥和心臟病藥等許多藥物。 手性藥物：手性藥物： 藥物的藥理作用是通過與體內(nèi)的大分子之間嚴格的手性識別和匹配而實現(xiàn)的. 雖然對映異構(gòu)體藥物的理化性質(zhì)基本相同，但由于藥物分子所作用的受體或靶位是由氨基酸、核苷、膜等組成的手性蛋白質(zhì)和核酸大分

4、子等，后者對與之結(jié)合的藥物分子的空間立體構(gòu)型有一定的要求。因此，對映異構(gòu)體在動物體內(nèi)往往呈現(xiàn)出藥效學(xué)和藥動學(xué)方面的差異。鑒于此，美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定，今后研制具有不對稱中心的藥物，必須給出手性拆分結(jié)果，歐盟也提出了相應(yīng)的要求。 震動了醫(yī)學(xué)界，當時以消旋體用作緩解妊娠反震動了醫(yī)學(xué)界，當時以消旋體用作緩解妊娠反應(yīng)藥物，但后來在歐洲發(fā)現(xiàn)曾服用此藥的孕婦產(chǎn)下應(yīng)藥物，但后來在歐洲發(fā)現(xiàn)曾服用此藥的孕婦產(chǎn)下四肢呈海豚狀的畸形兒。近期研究表明，兩個對映四肢呈海豚狀的畸形兒。近期研究表明，兩個對映體都有鎮(zhèn)靜作用，原因出自代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。體都有鎮(zhèn)靜作用，原因出自代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。S(-)S(-)沙沙利度胺利度胺的

5、二酰亞胺進行酶水解，生成鄰苯二甲酰谷的二酰亞胺進行酶水解，生成鄰苯二甲酰谷胺酸，后者可滲入胎盤，干擾胎兒的發(fā)育造成畸胎，胺酸，后者可滲入胎盤，干擾胎兒的發(fā)育造成畸胎，而而R(+)R(+)異構(gòu)不產(chǎn)生相同的代謝產(chǎn)物，因而不致畸。異構(gòu)不產(chǎn)生相同的代謝產(chǎn)物，因而不致畸。沙利度胺沙利度胺(Thalidomide,(Thalidomide,反應(yīng)停反應(yīng)停) )事件事件1.2 手性藥物對映體藥效學(xué)差異手性藥物對映體藥效學(xué)差異 只有一種對映體具有所要求的藥理活性只有一種對映體具有所要求的藥理活性, ,而另一種對而另一種對映體沒有藥理活性映體沒有藥理活性 一種對映體中的兩個化合物有等同的或接近等同的一種對映體中的

6、兩個化合物有等同的或接近等同的藥理活性藥理活性 兩種對映體具有不同的藥理活性兩種對映體具有不同的藥理活性 各對映體藥理活性相同但不相等各對映體藥理活性相同但不相等Examples 布洛芬布洛芬( (Ibuprofen)Ibuprofen)的活性成分是的活性成分是S(+)S(+)布洛芬，布洛芬，R(-)R(-)異構(gòu)體無效。異構(gòu)體無效。S(+)S(+)布布洛芬對慢性炎癥和風(fēng)濕病的療效與消旋體相當。但劑量僅為消旋體的一半。洛芬對慢性炎癥和風(fēng)濕病的療效與消旋體相當。但劑量僅為消旋體的一半。 萘普生萘普生(Naproxen)(Naproxen)是一種常用的抗炎和解熱鎮(zhèn)痛藥。目前主要以是一種常用的抗炎和解

7、熱鎮(zhèn)痛藥。目前主要以S(+)S(+)異構(gòu)異構(gòu)體上市，其體上市，其S(+)S(+)異構(gòu)體的抗炎和解熱鎮(zhèn)痛活性約為異構(gòu)體的抗炎和解熱鎮(zhèn)痛活性約為R(R(一一) )異構(gòu)體的異構(gòu)體的1O1O一一2O2O倍倍 。 左旋左旋氧氟沙星氧氟沙星(Levofloxacin(Levofloxacin) )是廣譜抗菌藥，其作用是外消旋體的二倍，是廣譜抗菌藥，其作用是外消旋體的二倍，是右旋體的是右旋體的8-128-12倍。而右旋體無效，且未發(fā)現(xiàn)有任何副作用。倍。而右旋體無效，且未發(fā)現(xiàn)有任何副作用。 環(huán)磷酰胺環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide(Cyclophosphamide) )是一種常見的抗腫瘤藥，目前仍以

8、外消旋體是一種常見的抗腫瘤藥，目前仍以外消旋體上市，其左旋體和右旋體均有抗腫瘤作用，但左旋體的抗腫瘤作用是右旋體的上市，其左旋體和右旋體均有抗腫瘤作用，但左旋體的抗腫瘤作用是右旋體的兩倍。兩倍。 1R1R，2R(-)2R(-)氯霉素氯霉素(Chioramphenico1)(Chioramphenico1)有抗菌活性，其他異構(gòu)體則無效。有抗菌活性，其他異構(gòu)體則無效。手性藥物兩種對映體的不同藥理作用手性藥物兩種對映體的不同藥理作用具有互補作用具有互補作用 奈必洛爾奈必洛爾是一種降壓藥，它的右旋體為是一種降壓藥，它的右旋體為B-B-受體受體阻滯劑，而左旋體能降低外周血管阻力。并對心阻滯劑，而左旋體能

9、降低外周血管阻力。并對心臟有保護作用，因此以外消旋體給藥為佳。臟有保護作用，因此以外消旋體給藥為佳。 鹽酸曲馬多鹽酸曲馬多(Tramado1)(Tramado1)的左旋體和右旋體的鎮(zhèn)的左旋體和右旋體的鎮(zhèn)痛作用的機理分別是激動嗎啡受體和抑制單胺遞痛作用的機理分別是激動嗎啡受體和抑制單胺遞質(zhì)再攝取，有協(xié)同作用，應(yīng)用其消旋體使其鎮(zhèn)痛質(zhì)再攝取，有協(xié)同作用，應(yīng)用其消旋體使其鎮(zhèn)痛作用增強作用增強。1.3 相關(guān)術(shù)語及分析方法相關(guān)術(shù)語及分析方法對映體組成測定方法對映體組成測定方法手性液相色譜手性氣相色譜毛細管電泳手性分離手性超臨界流體色譜手性固定相法手性流動相添加法手性試劑衍生化法Daicell 公司 Chi

10、racel 柱Chiralcel ODChiralpak AD比旋光度，核磁共振，氣相色譜，液相色譜等1.4 總結(jié)總結(jié) 手性藥物光學(xué)異構(gòu)體間表現(xiàn)出的藥動學(xué)和藥效差異顯著，所以，研究一個手性藥物時。僅對其外消旋體或某一個光學(xué)異構(gòu)體進行生物學(xué)評價是不夠的。必須對其所有的對映體分別進行生物學(xué)評價。在此基礎(chǔ)上再確定是以外消旋體還是以其某一個光學(xué)異構(gòu)體作為所要上市的新藥。 美國FDA 于1992年3月公布了一系列準則。以指導(dǎo)這類藥物的開發(fā)。要求對含有手性中心的藥物，分別作每個旋光異構(gòu)體的毒理和藥理臨床實驗及其活性強度、質(zhì)量和純度的測定。證明它們都無任何有害作用，甚至對已上市的外消旋體藥物也要按如此要求補

11、做研究工作，完善其研究資料。 因而近年來手性藥物的研究開發(fā)倍受關(guān)注。單一對映體藥物不斷上市。已有許多手性藥物經(jīng)“手性轉(zhuǎn)換”以單一對映體代替了過去的消旋體。 2 手性藥物的生物催化合成手性藥物的生物催化合成 尤其是利用水解酶類如脂肪酶、酯酶、蛋白酶拆分制備手性尤其是利用水解酶類如脂肪酶、酯酶、蛋白酶拆分制備手性化合物，利用微生物中酶的多樣性和立體選擇性，可以合成一些化合物，利用微生物中酶的多樣性和立體選擇性，可以合成一些化學(xué)方法難以實現(xiàn)的手性中間體?；瘜W(xué)方法難以實現(xiàn)的手性中間體。 例如麻黃堿例如麻黃堿(Ephedrine)(Ephedrine)可用發(fā)酵法制取，由苯甲醛和蔗糖可用發(fā)酵法制取，由苯甲

12、醛和蔗糖在啤酒酵母存在下縮合，生成左旋體中間體，再與甲胺縮合，催在啤酒酵母存在下縮合，生成左旋體中間體，再與甲胺縮合，催化氫化后得化氫化后得(1R(1R，2S)2S)一一( (一一) )麻黃堿。麻黃堿。 2.1 概述概述生物催化高度立體選擇性，底物專一性副反應(yīng)少，反應(yīng)條件溫和，可避免消旋，重排，異構(gòu)化的產(chǎn)生工藝和產(chǎn)品綠色Enantioselectivity立體選擇性生物催化信息素、萜類甾體等的合成氰醇的手性合成及氰醇裂解酶的應(yīng)用一些手性藥物中間體的合成光學(xué)純2-芳基丙酸的制備脂肪酶催化的酯化反應(yīng)制備手性合成子其它酶催化的立體選擇性反應(yīng)全細胞生物催化劑的立體選擇性反應(yīng)酵母介導(dǎo)的立體選擇性生物催化

13、 手性識別的原因：接受體或酶的活性位點對不同對映體，手性識別的原因：接受體或酶的活性位點對不同對映體，匹配度不一樣。匹配度不一樣。有機溶劑水溶性水不溶性有機溶劑水均一相水有機溶劑水雙液相水飽和有機溶劑均一相水水水有機溶劑二連續(xù)相有機溶劑分散相水連續(xù)相水分散相有機溶劑連續(xù)相反應(yīng)介質(zhì)反應(yīng)介質(zhì)2.2 非水介質(zhì)中的生物催化反應(yīng)非水介質(zhì)中的生物催化反應(yīng)反相膠束體系超臨界流體體系離子液體體系 反應(yīng)介質(zhì)的影響反應(yīng)介質(zhì)的影響通過影響底物、產(chǎn)物在水相和有機相中的分配， 從而影響它們在酶必需水層中的濃度來改變酶催化反應(yīng)速度直接與 酶必需水作用，強極性有機溶劑可溶解大量水，有奪走必需水的趨勢，導(dǎo)致酶失活對酶的直接影

14、響l 有機溶劑使底物基態(tài)能級下降或使酶底復(fù)合物能級升高l 有機溶劑分子進入酶活性中心，降低中心內(nèi)部極性并加強底物與酶 之間形成的氫鍵l 有機溶劑侵入會造成酶的三級結(jié)構(gòu)變化，間接改變酶活性中心結(jié)構(gòu)有機溶劑的極性有機溶劑的極性 溶劑的極性對酶的催化活力也有較大的影響。一般認為酶在非極性溶劑中的活力較高。logP越大，疏水越大，疏水性越強，酶的活力越大性越強，酶的活力越大。 但是過于增大溶劑的疏水性，酶的活力反而降低。這可能是因為溶劑的疏水性太強，疏水性的底物不容易從溶劑中擴散到酶分子的周圍，導(dǎo)致酶的活力降低。 同時也有資料表明，若溶劑的分子結(jié)構(gòu)和底物的結(jié)構(gòu)相似時，溶劑會作為酶活性中心的抑制劑而降低

15、酶的活力。表表 3 3 各種有機溶劑對各種有機溶劑對 NovozymeNovozyme 435435 催化酮洛芬酯化的影響催化酮洛芬酯化的影響 有機溶劑 LogP 值 ees 轉(zhuǎn)化率 E 二氧六環(huán) -1.1 2 3 3 乙腈 -0.33 5 7 4 異丁基甲基酮 1.32 17 19 6 二氯甲烷 1.47 3 4 7 異丙醚 1.90 17 43 2 甲苯 2.50 84 67 6 四氯甲烷 3 97 76 7 正己烷 3.5 81 89 2 值得說明的是溶劑在提高選擇性的同時并不一定會使反應(yīng)速率增加，也可能使反應(yīng)速率變慢。一個非常慢的反應(yīng)即使有很高的選擇性，也難有實際用途，而一個快速反應(yīng)即

16、使對映體選擇性稍差，也有可能得到高光學(xué)純度的產(chǎn)物。所以在選擇拆分介質(zhì)時，對酶的催化活力，對映體選擇性和反應(yīng)速率三者要兼顧。PSL脂肪酶催化潛手性二氫吡啶二羧基酯類衍生物的選擇性水解在不同的有機溶劑中，酶具有不同的立體選擇性，相同的酶在不同的有機體系反應(yīng)所得產(chǎn)物的構(gòu)型相反。 有機溶劑中酶的催化作用，水仍然是必需的基本條件。酶蛋白分子周圍緊密結(jié)合著一層水，成為必需水必需水。在絕對無水的體系中，酶不表現(xiàn)催化活性。 酶在有機相中必需水的含量有一個最佳值最佳值，當有機溶劑中必需水的含量超過最佳含水量時，酶容易形成聚集體而變得不穩(wěn)定，且催化活力降低。酶在不同的有機溶劑中保持一定的活力所需必需水的含量并不相

17、同。 同時，必需水的含量與溶劑的極性溶劑的極性有直接的關(guān)系。極性溶劑易與酶爭奪必需水，但當增加水的含量時，酶也可以在極性較大的溶劑中保持一定的活力。有機相含水量有機相含水量CRL催化2溴丙酸的酯化反應(yīng)COOHBrCRLn-BuOHhexaneCOBuBrCOOHBrR-S-Rac-溶劑含水量初速度選擇性E011170.0521210.07566390.12510081 酶催化的還原反應(yīng)能使分子內(nèi)的酶催化的還原反應(yīng)能使分子內(nèi)的酮基和碳碳雙酮基和碳碳雙鍵鍵立體選擇性地還原產(chǎn)生特定構(gòu)型的化合物，而常立體選擇性地還原產(chǎn)生特定構(gòu)型的化合物，而常規(guī)化學(xué)法還原酮和烯烴則產(chǎn)生消旋體，因此酶催化規(guī)化學(xué)法還原酮和

18、烯烴則產(chǎn)生消旋體，因此酶催化的還原反應(yīng)在手性藥物合成中有重要的應(yīng)用。的還原反應(yīng)在手性藥物合成中有重要的應(yīng)用。2.3 手性藥物的生物催化合成u 還原反應(yīng)還原反應(yīng)NHOMeOOCF3NHOMeOOCF3NHOMeOOCF3NHOMeOCF3NOMeOCF3OHOHNH3CCH3.HC橙色諾卡菌Yield 97%ee 99.9% 鈣拮抗劑類抗心絞痛藥，橙色諾卡菌（Nocardia salmonicolor）可以立體選擇還原酮。 SQ31765a. SQ31765b. 肉堿肉堿(L-Carnitine)肉堿(L-Carnitine) 6已在工業(yè)中得到應(yīng)用(圖2)。L-肉堿又稱維生素BT，其異構(gòu)體對人體

19、有營養(yǎng)保健，減肥健美的作用，而D-肉堿無生理活性且對L-肉堿有拮抗作用。利用酵母菌酵母菌BakersYeastBakersYeast催化不對稱還原得到目標產(chǎn)物。 c. BMS-210 620BMS-210 620 BMS-210 620(3)的合成中間體R)-醇(2)可由Spiwmonas Spiwmonas paucirrtobilispaucirrtobilis SC16113 SC16113菌株菌株催化還原1制得。反應(yīng)釜中加人樹脂使產(chǎn)物的回收過程簡單有效。 d.d. 3-3-吡啶乙醇胺吡啶乙醇胺3-吡啶乙醇胺(6)也是一種腎上腺能受體激動劑，一條實用的合成路線就是利用酵母菌酵母菌Cand

20、ida Candida sorbophilasorbophila催化不對稱還原4得到關(guān)鍵的手性3-吡啶乙醇胺中間體5，達到75%的產(chǎn)率和99.5%以上的ee值。當用啤酒醉母還原時只得到了70%-80%的ee值。( R ) - 地 諾 帕 明(Denopamine, 9)是首例具有口服活性和長效治療心臟病的藥物，利用一株高還原活力的白地白地霉菌株霉菌株GeotrichumGeotrichum sp. sp. G. 38還原-羰基羧酸酯(7)，得到相應(yīng)光學(xué)純的羥基酸(8)成功合成了（9）。e. (R)-地諾帕明地諾帕明(Denopamine)f.f. 索他洛爾索他洛爾(Sotalol(Sotalo

21、l) )索他洛爾(Sotalol)因為含有酸性的甲磺酰胺部分，是一種獨特的抗心率失常新藥。其d-型異構(gòu)體是一種純的類抗心率失常藥物。利用白地霉菌株白地霉菌株GeotrichumGeotrichum sp. G. sp. G.催化還原-氯代酮(10)得到光學(xué)活性的相應(yīng)氯代醇產(chǎn)物(11)成功制備了d-索他洛爾(12)(Scheme 3)。g.g. 托莫西汀托莫西汀 (Tomoxetine(Tomoxetine) )托莫西汀 (Tomoxetine,17)是首例去甲腎上腺素再攝取抑制劑，是一種抗抑郁藥，其(R)-(+)-異構(gòu)體藥效比其對映體高9倍。氟西汀(Fluoxetine,18)也是一種強效的抗

22、抑郁藥，而且其對許多病癥，如焦慮、酒精中毒、慢性痛、肥胖、善饑以及厭食等均有很好療效。利用啤酒酵母啤酒酵母催化不對稱還原苯甲酸乙酸乙酯(13)或3-氯苯丙酮(15)得到相應(yīng)的手性醇再經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化徑基的構(gòu)型翻轉(zhuǎn)分別制得兩種對映體產(chǎn)物。利用固定化的白白地霉菌株地霉菌株CeotrichumCeotrichum sp.G.38 sp.G.38催化還原13得到(S)-14合成了(R)-氟西汀(18)。Omapatrilat (1)是一種抗高血壓藥物酶法酶法/ /微生物法微生物法合成單一對映體是合成Omapatrilat的關(guān)鍵。利用谷氨酸酯脫氫酶還原胺化2-酮-6-羥基己酸得到6-羥基正亮氨酸。h. Oma

23、patrilati.索他洛爾索他洛爾u 氧化反應(yīng)氧化反應(yīng)生物催化的氧化反應(yīng)可以使分子內(nèi)非活潑的碳氫鍵立體選擇性氧化，產(chǎn)生特定構(gòu)性的羥基化合物羥基化合物，這種碳氫鍵非活潑氫用化學(xué)法很難氧化。甾體激素的微生物轉(zhuǎn)化是生物催化法在手性合成研究中應(yīng)用最早和最成功的例子，從而推動了生物催化的手性合成研究與發(fā)展。生物催化的氧化反應(yīng)較多的應(yīng)用在手性環(huán)氧化合物手性環(huán)氧化合物的合成當中。手性環(huán)氧化合物是非常重要的手性中間體，有廣泛的藥用價值。Shell和Gist-Brocades公司利用微生物的-羥基酶對丙烯醚進行了不對稱環(huán)氧化，生成了具有很大光學(xué)活性的(S)-環(huán)氧化物。這些方法同樣在合成-受體阻滯劑(S)-美托

24、洛爾(Metropolo1)和(S)-阿替洛爾(Atenolo1)工業(yè)工業(yè)得到了應(yīng)用。此外，可用于環(huán)氧化的微生物還有血紅素單氧化酶；甲烷單氧化酶和鹵素過氧化物酶。 利用微生物生物轉(zhuǎn)化制備甾體類藥物已有多年的歷史。常規(guī)化學(xué)方法很難氧化非活潑碳氫鍵，但是生物催化法卻能奏效。例如藍色梨頭酶（Absidia coerulea）AS3.65 能使17-羥基-11-脫氫皮質(zhì)酮（31）甾體環(huán)氧化產(chǎn)生氫化可的松（hydrocotison，32）。OOCH2OHOHOOCH2OHOHHO藍色梨頭霉50%-60%3132a. 甾體類激素甾體類激素 黑根霉（Rhizopus niger）能使孕酮（gestone，3

25、3）甾環(huán)環(huán)氧化產(chǎn)生11-羥基孕酮（34）。 OOCH3OOCH3HO黑根霉90%3334另外也可用微生物降解甾體的側(cè)鏈，例如谷甾醇（sitosterol，35）是植物油產(chǎn)生中的副產(chǎn)物，它被偶發(fā)分支桿菌（Mycobacterium fortuitum）的突變體氧化降解可出去側(cè)鏈生成雄甾二酮（androstenedione，36），后者是一種有價值的甾體類化合物合成的起始原料。OO偶發(fā)分支桿菌HO3536b. 卡托普利卡托普利卡托普利（captopril，38），又名巰甲丙脯酸。分子中含有兩個手性中心，活性取決于含巰基烷鏈的構(gòu)型，藥物分子其（S,S）-對映體是（R,S）-構(gòu)性藥物活性的100倍以上

26、。COOHCOOHClONCOOHHSONCOOHCandida rugosaNaSH1) SOCl22), NaOHNHCOOH也可以采用假單胞菌脂肪酶或黑曲霉脂肪酶水解拆分-甲基-乙酰硫代丙酸得到（S）-對映體，再經(jīng)酰氯化及與L-脯氨酸縮和可得到。COOHHSONCOOHSCOOCH3OCH3COSH1) 脯氨酸2) CH3OH, NH3SCOClSOCl2脂肪酶u 水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)青霉素和頭孢菌素青霉素和頭孢菌素 青霉素G，青霉素V和頭孢菌素C可以由發(fā)酵法生物合成，將他們的側(cè)鏈水解可以制備6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid， 6-APA

27、）、7-氨基頭孢烷酸（7-amino-cephalosporanic acid，7-ADCA），他們是半合成青霉素和半合成頭孢菌素衍生物的母核，是重要的制藥工業(yè)原料。D-苯甘氨酸和D-4-羥基苯甘氨酸是四種廣泛使用的抗生素的側(cè)鏈。通過酶法拆分消旋體海因類衍生物（53）可以得到D-4-羥基苯甘氨酸（54）。OHCCOOH+H2NCOOH+OHHNNHOOHOHNNHOOOH+HNNHOOHOHNH2OHOHHOHOONHH2NOOHH自發(fā)消旋化（少量）消旋體海因D-海因酶酰胺水解酶奧硝唑和賽克硝唑奧硝唑和賽克硝唑 奧硝唑（ornidazole，57）和賽克硝唑（secnidazole，58）是廣

28、泛用于治療厭氧菌、滴蟲等感染的新一代5-硝基米唑類抗菌素。它們分子中有一個和不對稱碳相連的仲醇，用酶催化拆分是比較快捷的方法。NNROHHO2NCH3NNRO2NCH3NNRO2NCH3+HHAcOAcOAmano Lipase AK3.手性藥物的酶促拆分手性藥物的酶促拆分定義：定義：生物催化手性拆分是以酶或生物選擇性催化外消旋底物中的某個對映體優(yōu)先反應(yīng)，再利用其與未反應(yīng)對映體的物理性能差異達到拆分目的。原理：原理：1）酶實際上是一個手性分子，和外消旋化合物中的兩個對映體以不同的速度進行反應(yīng)，從而達到動力學(xué)拆分的目的。2）如果兩個對映體以相同的速度反應(yīng)，但酶對一個反應(yīng)中心所產(chǎn)生的構(gòu)型是相同的，

29、結(jié)果產(chǎn)生兩個非對映體而被拆分。3）若一個底物為前手性的，它發(fā)生不對稱反應(yīng)而生成光學(xué)活性化合物。C*esterEnzymedl-體S-alcoholR-esterR2C*OHR1R2+C*R2R3R1R3OHROR3R1AcylationHydrolysisa.a.環(huán)氧化物水解環(huán)氧化物水解3.1 手性藥物的酶促拆分不對稱水解反應(yīng)不對稱水解反應(yīng)藥物中間體A. niger strains (SC 16310, SC 16311)Rhodotorula glutinis SC 1629345的產(chǎn)率，e.e.值95，E值在25左右甲基叔丁基醚 (MTBE)產(chǎn)率45，e.e.值達到99.9b.b. 腈水解

30、腈水解腈水解酶無須輔酶，催化氰基直接水解成羧基，而腈水合酶具有緊密結(jié)合的金屬離子(Co或Fe)作為輔酶，首先催化氰基生成相應(yīng)的酰胺，再經(jīng)過酰胺酶或蛋白酶催化水解為羧基。(R)-a-氟苯乙酸(R)-異構(gòu)體的氰基水解為羧酸，(S)-異構(gòu)體不發(fā)生反應(yīng)通常是將要拆分的外消旋的底物進行酯化，然后再用脂肪酶立體選擇性水解，從而獲取其中一個對映體而另外一個不反應(yīng)的對映體仍以酯的形式存在。c.c. 酯水解酯水解ee%=99%ArOCF3CH3OAr = 3-benzoylphenylH2OlipaseorganicsolventArOHOArOCF3O+rac-2S-2R-1CH3HHCH3S-酮洛芬Koul

31、等人用Trichosporon sp. (TSL)，一種在當?shù)剜l(xiāng)村發(fā)酵干酪分離出的菌種通過不對稱水解反應(yīng)得到光化學(xué)純度的萘普生，大批量生產(chǎn)已經(jīng)達到千克級水平。 ?；磻?yīng)?；磻?yīng)酯化反應(yīng)酯交換反應(yīng)酰胺化反應(yīng)LiapseMY(triacylglycerol ester hydrolases, EC 3.1.1.3) from Candida rugosa (30 unites/mg of solid)通過不對稱酯交換反應(yīng)得到光化學(xué)純度的萘普生酯，然后進一步水解即可得到目標產(chǎn)物利用脂肪酶催化的選擇性酯化反應(yīng)，還可以直接用酸而不用酯。例如，外消旋酮洛芬的拆分。在含水0.1-0.5%（v/v）的四氯甲烷

32、中用脂肪酶Candida antarctica Lipase催化酮洛芬R異構(gòu)體與乙醇發(fā)生酯交換反應(yīng)可以將外消旋酮洛芬加以分離。產(chǎn)物酯的對映體過剩值超過95%，其異構(gòu)體酸可以游離狀態(tài)回收。OHO Ethanol LipaseOrganic solventOCH3OHOOCH3OROOCH3+呋喃型木酚醇(6)有保肝抗菌以及促進傷口愈合的功能，(2S，3R )-(6)的療效遠大于(2R，3S)-(6)。脂肪酶區(qū)域選擇性催化其中一個羥基酯化并同時在另一個羥基上表達出立體選擇性(見下圖)。影響酶促拆分的幾個因素影響酶促拆分的幾個因素 酶源的影響 溶劑的影響 溫度的影響 底物結(jié)構(gòu)的影響 反應(yīng)時間的影響b

33、iocatalystoldnew固定化酶的純化酶的改性酶的修飾新的菌種微生物Enzyme activity（aw，pHenzyme form，solvent）Medium engineeringSolvent engineeringEnzyme engineeringProtein engineering3.2 提高立體選擇性的方法提高立體選擇性的方法酶酶 商品酶或粗酶中的雜酶或添加劑會降低酶的對映體選擇性，因此純化酶可以提高起其選擇性。酶的修飾也是提高反應(yīng)專一性和產(chǎn)率行之有效的方法。酶的純化酶的修飾酶的改性酶的預(yù)處理1.酶的活化酶的活化其他化學(xué)或物理修飾蛋白質(zhì)工程基因工程添加劑賦形劑鹽、大環(huán)

34、化合物、酸、堿表面活性劑、印記分子等固定化技術(shù)交聯(lián)、結(jié)晶、PEG定向進化定點突變過量表達OOOO由于生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的酶幾乎都來源于微生物，如何篩選出含有所需酶的微生物顯得尤為重要。篩選中要注意以下3個要點：設(shè)計酶催化反應(yīng)過程以確定所需酶的種類；確定將作選擇性培養(yǎng)的微生物類別；確定便捷靈敏的檢測方法以便選擇所培養(yǎng)的微生物。隨著科技的發(fā)展，新酶層出不窮。英國的Snell等從當?shù)睾Y選出一種能降解乙腈的細菌Rhodococcus AJ270，其含有的一種腈水合酶具有單一的酰胺酶活力，能用于腈與酰胺的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。David用該酶對消旋布洛芬酰胺進行動力學(xué)拆分，由于其對S布洛芬酰胺的選擇性，水解速度快，經(jīng)

35、過適當反應(yīng)時間后，可得到ee值為90%94%的S布洛芬。但若反應(yīng)時間多短，則轉(zhuǎn)化率不完全，底物利用率低；若反應(yīng)時間過長，則底物完全水解，得到的將是產(chǎn)物的消旋混合體。發(fā)展新酶反應(yīng)介質(zhì)溶劑工程溶劑工程(solvent engineering) ：通過改變?nèi)軇┛梢哉{(diào)節(jié)酶的活性和選擇性，改變酶的動力學(xué)特性和穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)該技術(shù)不必改變蛋白質(zhì)本身，只要改變反應(yīng)介質(zhì)就可以改變酶的催化特性，它在生物催化劑的開發(fā)與利用中將起著重要作用。溶劑的選擇需注意溶劑的選擇需注意：溶劑對底物和產(chǎn)物的溶解性要好，能促進底物和產(chǎn)物的擴散，防止由于產(chǎn)物在酶分子周圍的積累，而影響酶的催化反應(yīng)；溶劑對反應(yīng)必須是惰性的，不參與酶的催化反應(yīng)；溶劑的毒性、成本以及產(chǎn)物從溶劑中分離、純化等問題。多相反應(yīng)體系離子液體 多相反應(yīng)體系 水有機溶劑兩相體系（biphasic aqu