體內(nèi)模型MSC組織再生功能檢測指標

1、MSC的組織修復作用已有實驗證實，盡管MSC可以歸巢到心肌梗死、腎臟損傷部位，但外源的MSC在梗死部 位存活率很低甚至不存在。很可能是因為局部微環(huán)境條件苛刻，MSC生長需要的條件不足， 如炎癥，氧壓，細胞毒性，胞外基質(zhì)缺乏等。在腎臟損傷中，外源的ISC移植后再受損腎臟 部位的數(shù)量和比例幾乎是微不足道的，但是腎臟的保護作用和功能恢復作用及動物的存活率 是顯著的，因此外源MSC分化為受損細胞并代替原來的細胞的推測還需要幾乎被否定，MSC 的旁分泌機制很可能是MSC治療效果的關(guān)鍵機制。MSC的旁分泌機制是通過MSC分泌細胞保護蛋白組和組織修復作用來促進血管新生、抗炎、 抗纖維化作用，組織修復作用包括

2、抗凋亡和促有絲分裂作用。此外MSC分泌的細胞小體對受 損組織修復有重要作用。MSC組織修復機制促血管生成因子：MSC分泌的HGF （肝細胞生長因子）卜VEGF （血管內(nèi)皮生長因子）卜TGF-1 （轉(zhuǎn)化生長因子）卜 bFGF （成纖維細胞生長因子）T、PDGF （血小板衍生因子）T、 內(nèi)皮素（endothelin）T、表皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin）T等?？寡仔宰饔茫篗SC分泌的抗炎性因子有IL-10 T、bFGF T、TGF- aT、Bcl-2 T, MSC的抗炎性作用還 表現(xiàn)在抑制T細胞、NK細胞、B細胞的增殖和抑制中性粒細胞產(chǎn)生H2O2?？估w維化作用：纖維化逆轉(zhuǎn)作用：組織金屬蛋白酶抑制

3、劑（TIMP-1）J、TGF-BJ的表達MSC移植后，心肌梗塞大鼠心臟的1型和3型膠原表達顯著降低，組織金屬蛋白酶抑制劑 （TIMP-1）、TGF-B表達顯著降低。促細胞分裂增殖的因子：HGF （肝細胞生長因子）T、IGF-1 （胰島素樣生長因子）T、EGF （上皮細胞生長因子）T、bFGF （成纖維細胞生長因子）T、PDGF （血小板衍生因子）T, AKT1是一種蛋白激 酶，在細胞生存、增殖和代謝活動中發(fā)揮重要作用。抗細胞凋亡作用：MSC分泌的VEGF T、IGF-1 T、SDF-1 a T具有抗細胞凋亡的作用。Galectin-3 （半乳糖凝集素3,具有促進和抑制細胞凋亡的雙重作用），Sm

4、ad-5基因、sRFP-1 基因、sRFP-4基因、Bcl-2基因；MSC通過調(diào)節(jié)腎臟細胞過表達的Lnc2基因來抑制細胞凋 亡，同時也提高了細胞生長因子的表達。促炎性因子：IL-6八 TNF-aJ、INF-丫八IL-1B1、一氧化氮合酶J分泌囊泡/小體：MSC分泌的囊泡，在治療急性腎損傷、急性肺損傷、肺纖維化、心血管疾病等有顯著 效果。通過細胞保護作用和促血管生成作用來修復受損器官或組織。MSC分泌的囊泡通過釋放促血管生成因子：VEGF、bFGF和PDGF來修復心肌缺血疾 病模型。神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌：顆粒蛋白酶前體和金屬蛋白酶-1 (TIMP-1) T、人分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(sfrp2) T

5、、IGF-1 (胰島素生長因子)f、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) f、神經(jīng)膠質(zhì)細胞營養(yǎng)因子f (GDNF)和神經(jīng)生長因子T (NGF)。MSC分泌趨化因子：SDF-1 f、IL-6 f、IL-8 f、CXC f、MCP-1 f (單核趨化蛋白)等使免疫細胞歸巢至損 傷部位。MSC組織修復的法規(guī)及理解干細胞制劑質(zhì)量控制和臨床前研究指導原則(試行)相關(guān)法規(guī)中，細胞制劑的質(zhì)量 檢驗里面對生物學效力試驗的有關(guān)規(guī)定雖然沒有明確規(guī)定干細胞制劑組織再生能力的標準， 但規(guī)定涵蓋了干細胞制劑的組織再生能力。法規(guī)內(nèi)容：生物學效力試驗可通過檢測干細胞分化潛能、誘導分化細胞的結(jié)構(gòu)和生理功 能、對免疫細胞的調(diào)節(jié)能力、

6、分泌特定細胞因子、表達特定基因和/或蛋白等功能，判斷干 細胞制劑與治療相關(guān)的生物學有效性。對間充質(zhì)干細胞，無論何種來源，應進行體外多種類型細胞(如成脂肪細胞、成軟骨細 胞、成骨細胞等)分化能力的檢測，以判斷其細胞分化的多能性(multipotency)。對未分 化的胚胎干細胞和iPS細胞，須通過體外擬胚胎體形成能力，或在SCID鼠體內(nèi)形成畸胎瘤 的能力，檢測其細胞分化的多能性(pluripotency)。除此以外，作為特定生物學效應試驗， 項目申請者應提供與其治療適應癥相關(guān)的生物學效應檢驗內(nèi)容及結(jié)果。我對間充質(zhì)干細胞組織再生能力的理解，包括兩方面：1、間充質(zhì)干細胞在體外定向誘 導生成組織細胞及

7、組織的能力。2、間充質(zhì)干細胞在各種適應癥中發(fā)揮的組織細胞再生或分 泌組織細胞再生相關(guān)因子的能力。第一方面間充質(zhì)干細胞在體外定向誘導生成組織細胞及組織的能力，我們可以在體外進 行檢測，但是第二方面間充質(zhì)干細胞在各種適應癥中發(fā)揮的組織細胞再生或分泌組織細胞再 生相關(guān)因子的能力，就需要在各種適應癥中去檢測，目前，我們可以通過跟蹤做各種適應癥 的其他小組的治療進程，與他們協(xié)作，在各種適應癥治療過程中，檢測組織細胞再生的相關(guān) 指標，來取得我們想要的檢測結(jié)果。目前，涉及自體或異體MSC的臨床試驗項目，已經(jīng)獲得美國國家食品藥物監(jiān)督管理局 批準。這些項目包括：（I ）異體MSC用于造血干細胞移植后移植物抗宿主

8、病的治療;（2）異體 MSC治療克隆氏??；自體MSC治療多發(fā)性硬化癥；MSC治療肝臟纖維化；（5 ）自體 MSC用于急性脊髓損傷;（6）MSC用于骨折后骨不連;MSC治療半月板損傷;（8）心臟缺血 性疾病的治療。上述臨床試驗分別接人13期，在國內(nèi)，相關(guān)的實驗及臨床研究亦獲得廣 泛開展，多家單位已經(jīng)開展了自體或異體MSC細胞治療項目.用于包括骨修復、心肌梗死、 外周血管病等多種疾病的預防或治療研究。各種適應癥中MSC的組織修復作用在機體正常的組織損傷修復過程中，MSC是一種重要的參與組織再生的細胞庫。在組 織損傷引起的特殊信號作用下，MSC遷徙至損傷部位，在局部增殖，并依據(jù)不同的損傷信 息而沿著

9、不同的途徑分化。MSC易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力旺盛，因此，MSC是一種實用的組織修復種子細胞。目前關(guān)于MSC的組織再生功能有兩種理論:其一，將體外擴增的M5C移植到組織損傷部位， 在局部微環(huán)境作用下，定向分化為某一特定類型功能細胞，直接參與組織損傷修復過程其 二，移植于損傷部位的細胞，分泌多種生物活性物質(zhì)，包括細胞因子和細胞生長因子等，以 改善組織損傷部位再生微循環(huán)，促進宿主組織中殘存的干/祖細胞增殖分化，MSC間接參與 了組織修復過程。MSC改善組織再生微環(huán)境，表現(xiàn)為細胞所分泌的生物活性物質(zhì)具備的多種功能，包括： （1）趨化周闊的宿主干/祖細胞遷徙至損傷那位；（2）促進干/祖細胞的增殖分化

10、；（3）抑 制受損傷細胞的凋亡；（4）促進毛細血管新生;（5）激活周圍細胞金屬硫蛋白酶活性，抑制 瘢痕形成；（6）調(diào)節(jié)免疫細胞功能，抑制炎性反應。目前，關(guān)于MSC組織再生功能的檢測還沒有一個明確的標準。在體外檢測中，只能通過 檢測MSC分化為受損組織細胞的能力和MSC分泌修復組織損傷有關(guān)細胞因子、抗炎因子、營 養(yǎng)因子等來鑒定MSC的組織再生功能，這是判定MSC組織再生功能的基礎，但是這樣的評判 也存在很大缺陷的，MSC在體外的培養(yǎng)環(huán)境和在體內(nèi)微環(huán)境中存在很大差別，微環(huán)境下細胞 之間的接觸作用，損傷細胞釋放的因子對MSC的刺激作用和趨化作用等可能都對MSC分泌的 細胞因子種類和劑量有影響。因此，

11、通過在各種適應癥治療時，對MSC在微環(huán)境中的組織再 生功能的相關(guān)指標進行檢測是必要的。MSC治療肝硬化模型在CC14誘導的肝硬化模型中，MSC通過抑制肝臟膠原合成、誘導肝臟內(nèi)源干細胞的分 化增殖、抑制CC14引起的肝損傷和炎癥、促進肝臟血管再生等作用來改善肝臟病變狀況。 檢測指標包括：1、MSC抑制膠原合成作用：肝病變部位膠原的含量2、促細胞生長作用：HGF T、bFGF （成纖維細胞生長因子）T、PDGF （血小板衍生因子） f3、纖維化逆轉(zhuǎn)作用：組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP-l）J、TGF-BJ的表達4、炎性和抗炎性因子檢測：IL-6J、TNF-aJ、INF-丫h IL-1BJ、一氧化氮

12、合酶JIL-10 f、bFGFf、TGF-af、Bcl-2 f, MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制T細胞、NK細胞、B細胞的增殖和抑制中性粒細胞產(chǎn)生H2O2。5、促血管生成作用：HGF （肝細胞生長因子）f、VEGF （血管內(nèi)皮生長因子）f、 TGF-1 （轉(zhuǎn)化生長因子）f、bFGF （成纖維細胞生長因子）f、PDGF （血小板衍生 因子）f、內(nèi)皮素（endothelin）f、表皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin）f等。6、檢測輸注陽性標記MSC在受損組織中是否存在。7、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對照組相比是否有恢復的趨勢。8、觀察統(tǒng)計治療組與對照組動物的精神狀態(tài)或存活狀態(tài)。9、組織切片觀察治療組

13、受損組織結(jié)構(gòu)、功能細胞分布是否趨于正常。10、檢測受損組織的功能是否有所改善。11、病理切片觀察受損組織周圍炎性細胞情況，檢測炎性因子分泌情況。12、受損組織中趨化因子IL-8、CXC、MCP-1 （單核趨化蛋白）等的含量。MSC治療腎損傷模型在急性腎損傷、慢性腎損傷等動物模型中，MSC通過誘導腎臟內(nèi)源干細胞的分化增殖、 腎小管上皮細胞增殖、抑制腎臟損傷和炎癥、促進腎臟血管再生等作用改善腎臟功能。檢測指標包括：1、促細胞生長作用：HGF、bFGF （成纖維細胞生長因子）t、PDGF （血小板衍生因 子）t2、炎性和抗炎性因子檢測：IL-6 I、TNF-a I、INF-y I、IL-邛I、一氧化

14、氮合酶IIL-10 t、bFGFt、TGF-at、Bcl-2 t, MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制T細胞、NK 細胞、B細胞的增殖和抑制中性粒細胞產(chǎn)生H2O2。3、促血管生成作用：HGF （肝細胞生長因子）t、VEGF （血管內(nèi)皮生長因子）t、 TGF-1 （轉(zhuǎn)化生長因子）t、bFGF （成纖維細胞生長因子）t、PDGF （血小板 衍生因子）t、內(nèi)皮素（endothelin ） t、表皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin ） t等。4、檢測輸注陽性標記MSC在受損組織中是否存在。5、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對照組相比是否有恢復的趨勢。6、觀察統(tǒng)計治療組與對照組動物的精神狀態(tài)或存活狀態(tài)。7、組織切

15、片觀察治療組受損組織結(jié)構(gòu)、功能細胞分布是否趨于正常。8、檢測受損組織的功能是否有所改善。9、病理切片觀察受損組織周圍炎性細胞情況，檢測炎性因子分泌情況。10、受損組織中趨化因子IL-8、CXC、MCP-1 （單核趨化蛋白）的含量。MSC修復壞死胰腺組織造模：處理胰腺組織，造胰腺組織壞色模型：開腹結(jié)扎胰腺組織，7-8小時后，胰尾局部組 織變黑壞死，周圍有炎性細胞浸潤。治療：在胰腺未損傷部位植入胰腺DAPI標記的胰腺MSC細胞。檢測指標：1、觀察胰腺組織外觀是否趨于正常，切片胰島細胞是否趨于正常；2、DAPI標記的陽性MSC在胰腺組織是否存在，數(shù)量多少；3、治療組和未治療組的動物精神狀態(tài)和成活率對

16、比；4、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對照組相比是否有恢復的趨勢。5、組織切片觀察治療組受損組織結(jié)構(gòu)、功能細胞分布是否趨于正常。6、檢測受損組織的功能是否有所改善。7、病理切片觀察受損組織周圍炎性細胞情況，檢測炎性因子分泌情況。8、受損組織中趨化因子IL-8、CXC、MCP-1 （單核趨化蛋白）的含量。9、促細胞生長作用：HGF、bFGF （成纖維細胞生長因子）T、PDGF （血小板衍生因子） f10、炎性和抗炎性因子檢測:IL-6J、TNF-aJ、INF-丫h IL-1BJ、一氧化氮合酶JIL-10 f、bFGFf、TGF-af、Bcl-2 f, MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制T細胞、NK 細胞

17、、B細胞的增殖和抑制中性粒細胞產(chǎn)生H2O2。11、促血管生成作用：HGF （肝細胞生長因子）f、VEGF （血管內(nèi)皮生長因子）f、 TGF-1 （轉(zhuǎn)化生長因子）f、bFGF （成纖維細胞生長因子）f、PDGF （血小板衍生因 子）f、內(nèi)皮素（endothelin）f、表皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin）f等。MSC用于心血管疾病的治療在心肌梗塞、心肌缺血性損傷等模型中，MSC的治療作用表現(xiàn)為保護心肌細胞、促進 心臟祖細胞的分化增殖、抑制心臟炎癥反應、促進心臟血管生成，促進神經(jīng)細胞再生、改善 心臟功能。檢測指標包括：1、觀察心臟組織外觀是否趨于正常，切片心肌細胞是否趨于正常；2、移植陽性MSC在

18、心臟受損部位是否存在，數(shù)量多少；3、治療組和未治療組的動物精神狀態(tài)和成活率對比；4、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對照組相比是否有恢復的趨勢。5、組織切片觀察治療組受損心臟組織結(jié)構(gòu)、功能細胞分布是否趨于正常。6、檢測受損心臟組織的功能是否有所改善。檢測神經(jīng)前體細胞（NPC）的增殖膠質(zhì)纖維酸 性蛋白（GFAP）的表達。7、病理切片觀察受損心臟組織周圍炎性細胞情況，檢測炎性因子分泌情況。8、受損組織中趨化因子IL-8、CXC、MCP-1 （單核趨化蛋白）的含量。9、促細胞生長作用：HGF、bFGF （成纖維細胞生長因子）f、PDGF （血小板衍生因子）T、IGF-110、炎性和抗炎性因子檢測:IL-6

19、J、TNF-aJ、INF-丫h IL-1BJ、一氧化氮合酶J IL-10 T、bFGF T、TGF-a T、Bcl-2 T, MSC移植可以減少心肌層CD68+T細胞的增 加和減少單核細胞趨化蛋白（MCP-1）的表達。11、促血管生成作用：HGF （肝細胞生長因子）T、VEGF （血管內(nèi)皮生長因子）T、 TGF-1 （轉(zhuǎn)化生長因子）T、bFGF （成纖維細胞生長因子）T、PDGF （血小板衍 生因子）T、內(nèi)皮素（endothelin）T、表皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin）T等。12、神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌：顆粒蛋白酶前體和金屬蛋白酶1 （TIMP1 ）、人分泌型卷曲相關(guān) 蛋白2（sfrp2）、I

20、GF-1 （胰島素生長因子）、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)膠質(zhì)細胞 營養(yǎng)因子（GDNF）和神經(jīng)生長因子（NGF）。MSC用于肺纖維化模型在博來霉素誘導的肺纖維化模型中，MSC移植可以抑制肺纖維化，同時MSC產(chǎn)生IL-1 受體拮抗劑（一種抗炎性的可溶性因子），減輕博來霉素導致的肺損傷。雖然有一些實驗證據(jù)，但是目前MSC抑制肺臟纖維化還有爭議。檢測指標：1、MSC抑制膠原合成作用：肺病變部位膠原的含量2、促細胞生長作用：HGF、bFGF （成纖維細胞生長因子）T、PDGF （血小板衍生因子）T3、纖維化逆轉(zhuǎn)作用：組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP-1）J、TGF-BJ的表達4、炎性和抗炎性因子

21、檢測：IL-6J、TNF-aJ、INF-丫h IL-1BJ、一氧化氮合酶JIL-10 T、bFGF T、TGF-a T、Bcl-2 T, MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制T細胞、NK細 胞、B細胞的增殖和抑制中性粒細胞產(chǎn)生H2O2。5、促血管生成作用：HGF （肝細胞生長因子）T、VEGF （血管內(nèi)皮生長因子）T、 TGF-1 （轉(zhuǎn)化生長因子）T、bFGF （成纖維細胞生長因子）T、PDGF （血小板衍生因 子）T、內(nèi)皮素（endothelin）T、表皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin）T等。6、檢測輸注陽性標記MSC在受損組織中是否存在。7、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對照組相比是否有恢復的趨勢。

22、8、觀察統(tǒng)計治療組與對照組動物的精神狀態(tài)或存活狀態(tài)。9、組織切片觀察治療組受損組織結(jié)構(gòu)、功能細胞分布是否趨于正常。10、檢測受損組織的功能是否有所改善。11、12、病理切片觀察受損組織周圍炎性細胞情況，檢測炎性因子分泌情況。受損組織中趨化因子IL-8、CXC、MCP-1 （單核趨化蛋白）的含量。人肝細胞生長因子（HGF ）ELISA試劑盒（用于血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi)）原理本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人HGF單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中 的HGF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人HGF，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧 化物酶標記的Streptavidi

23、n與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在 450nm處測OD值，HGF濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中HGF濃 度。試劑盒組成（2-8 保存）酶標板 （Coated Wells）96孔10 X標本稀釋液（Sample12ml Buffer ）標準品（Standards ） ： 8ng/2 瓶 瓶第一抗體工作液（Biotinylated12ml酶標抗體工作液 (Enzyme12mlConjugate )20 X濃縮洗滌液(Wash Buffer ) 50ml底物工作液（TMB Solution）終止液(Stop Solution )12ml12ml1.2.3.4.5.6.7.8.Antibody ）準備試劑與收集血樣1 .收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8 保 存48小時；更長時間須冷凍（-20 或-70 ）保存，避免反復凍融。2 .標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成16000p g/ml的溶液。設標準管 8