凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)EMSA

1、1)什么是凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)？凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋

2、白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來(lái)確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來(lái)確定特異結(jié)合。2)作這樣的實(shí)驗(yàn)需要什么試劑？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來(lái)源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用g-32P和T4多核苷酸激酶來(lái)作末端標(biāo)記，同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。Promega公

3、司的Riboprobe?/sup系統(tǒng)（a,b）（目錄號(hào)P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素標(biāo)記的RNA的體外合成，DNA5末端標(biāo)記系統(tǒng)（目錄號(hào)U2010）用于制備DNA探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage?/sup分析。3)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提供了什么試

4、劑？Promega公司提供一種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實(shí)驗(yàn)的 一種正對(duì)照。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸，對(duì)照DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標(biāo)記所需的試劑。Core 系統(tǒng)（目錄號(hào)E3050）包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達(dá)AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液（5），和能作20次對(duì)照實(shí)驗(yàn)的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)（目錄號(hào)E3300）含另外5個(gè)雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB,、NF-kB、 TFIID結(jié)合位點(diǎn)的同源序列

5、。這些寡核苷酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針，或在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中用作非特異性探針。參考凝膠遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)TB110獲取更多的資料。4)成功進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化哪些因素？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)在理論上很簡(jiǎn)單也很快速，但要成功地進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來(lái)源和探針結(jié)合位點(diǎn)特點(diǎn)的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會(huì)使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH, 聚丙烯凝膠電泳的特點(diǎn)和電泳條件，保溫時(shí)間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）?？傊?，反應(yīng)總體積應(yīng)最小（20ul）。為滿足一般要求

6、，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油，0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的起始。參考凝膠遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)TB110獲取更多的資料。5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，這些引物的序列來(lái)源是什么？有各類dsDNA探針，它們含各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的同源結(jié)合位點(diǎn)。下表列出了所能提供的探針，和這些引物序列的出處。

7、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子探針-探針名 目錄號(hào) 序列（上鏈） 序列的出處Sp1 E3231,E3232 5-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3 SV40啟動(dòng)子（1）AP1 E3201 E3202 5-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3 膠原酶基因TRE（2）AP2 E3211 E3212 5-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3人金屬硫堇II a(3)基因NF-kB E3291, E3292, 5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3鼠Igk輕鏈基因（4）Oct1 E3241 E3242 5-TGT

8、 CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3 Ig重鏈基因（5）CREB E3281 E3282 5-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3大鼠生長(zhǎng)激素抑制基因（6）TFIID E3221 E3222 5-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3belta-1球蛋白啟動(dòng)子只列出了上鏈的序列，探針是雙鏈，下鏈序列和上鏈序列配對(duì)。黑體字表明序列來(lái)源于指定的基因序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列用下線表明。一般而言，周圍的核苷酸是任意。6)在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？目的DNA的長(zhǎng)度應(yīng)小于300bp，以有利于非結(jié)合

9、探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp）,這樣結(jié)合位點(diǎn)可和其他因子的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)別開(kāi)。長(zhǎng)的限制性酶切片段可用于對(duì)推定的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI 印跡對(duì)蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。7)用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來(lái)源時(shí)，每1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成

10、特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識(shí)別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。1AP1：AP1（激活蛋白1）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它結(jié)合的同源序列為5-TGAGTCA-3。當(dāng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在AP1的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，這些基因可以被誘導(dǎo)，比如用佛波酯可誘導(dǎo)蛋白激酶C（2，7）。在細(xì)胞中，AP1形成c-Jun或Jun相關(guān)蛋白的同聚雙體，或者形成c-Jun或Jun相關(guān)蛋白和c-Fos或Fos相關(guān)抗原（Fras）的異源雙體。Fos蛋白自身不能形成同聚雙體，并不能單獨(dú)和AP1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。c-Jun蛋白是一個(gè)40kDa的單體蛋白并

11、通過(guò)亮氨酸拉鏈形成同聚雙體。在HeLa細(xì)胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚雙體。在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中，形成一個(gè)特異的復(fù)合物。當(dāng)作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定AP1的活力時(shí)，除了基本的溶液組分外，應(yīng)將0.01mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到結(jié)合緩沖液中。如用純化的蛋白，則用1-2ug的蛋白來(lái)檢測(cè)遷移復(fù)合物。2AP2：AP2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可分別作為TPA-和cAMP誘導(dǎo)因子（10）。它是一個(gè)52 kDa的蛋白，識(shí)別的同源序列為5-CCCCAGGC-3或5-GCCNNGGC-3（3）。這個(gè)因子對(duì)視黃酸特別敏感，可能在形態(tài)發(fā)生中起著重要作用。H

12、eLa細(xì)胞核抽提物和AP2同源DNA探針形成一個(gè)特定的復(fù)合物。用純化的蛋白作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)用20-50ng的蛋白。3CREB：CREB是一個(gè)37 kDa的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)cAMP應(yīng)答，識(shí)別5-T（G/T）ACGTCA-3DNA同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)而形成同聚雙體，相關(guān)的基本結(jié)構(gòu)域和c-JunDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物時(shí)，能和CREB同源序列形成一個(gè)復(fù)合物。4NF-kB：NF-kB最初被鑒定為在B細(xì)胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強(qiáng)子結(jié)合。但隨后在非B-細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，形成NF-kB和IkB的復(fù)合物。最初在DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物中分離的NF-kB是由p65

13、(RelA)和p50構(gòu)成的異源雙聚體。其他分離的單體包括p49（也可稱為p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75單體起反式激活作用。p50，p49（p52）單體具有DNA結(jié)合活力，但只具有微量的反式激活作用。據(jù)報(bào)道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉(zhuǎn)錄活力的異源雙體，類似于p50/ p65異源雙體。p49/ p65和p50/ p65異源雙體在細(xì)胞質(zhì)中受一種叫IkBa/MAD-3的抑制劑調(diào)節(jié)。IkB和p65單體結(jié)合，阻制了細(xì)胞核中的定位和DNA的結(jié)合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA微弱地結(jié)合。Poly(dI:dC)能抑制這一反應(yīng)（14）。p

14、49和p50也能形成同源雙聚體，但在細(xì)胞中的濃度很低。通常，在作NF-kB的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，在20ul的反應(yīng)體積中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。當(dāng)用純化的蛋白時(shí)，250-300ng足以形成凝膠遷移復(fù)合物，而需用10ug的HeLa細(xì)胞核抽提物。凝膠遷移復(fù)合物在室溫中保溫30分鐘，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復(fù)合物。含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)色素的加樣溶液只能加入到陰性對(duì)照反應(yīng)中，因這兩

15、種色素會(huì)加劇NF-kB復(fù)合物的解離。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白來(lái)源時(shí)，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復(fù)合物，即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體。在表達(dá)p49，p50，p65的細(xì)胞中，可檢測(cè)到4個(gè)序列特異的凝膠遷移復(fù)合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高濃度的p65，可檢測(cè)到微量的p65/p65。下列試劑可加強(qiáng)NF-kB在體外的結(jié)合：mM的GTP，ATP，精胺，亞精胺，鋇或鈣離子，ng的Co+3(NH3)6（12）。5OCT1：OCT1是OCT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家簇中的一員，顯然在哺乳細(xì)胞中存在比較廣泛（5）。POU結(jié)構(gòu)域

16、包括POU-box和Homeo結(jié)構(gòu)域。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物時(shí)，可檢測(cè)到一個(gè)與OCT1同源探針形成的序列同源凝膠遷移復(fù)合物。6SP1：SP1是一個(gè)O-糖基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它識(shí)別10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的同源序列5-GGGGCGGGGC-3（1）。核心識(shí)別序列是5-GGGGCGGG-3。同核心序列相似的序列常存在于啟動(dòng)子中。SV40的早期啟動(dòng)子就是一個(gè)例子，它是第一個(gè)可以結(jié)合SP1的啟動(dòng)子。根據(jù)糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)鋅指紋決定了序列的特異性。HeLa細(xì)胞核抽提物與SP1同源探針形成特異的凝膠遷移復(fù)合物。7TFIID/TFIIB：TFIID和TFIIB是

17、基本的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與RNA聚合酶II啟動(dòng)子的基本的轉(zhuǎn)錄（16）。TFIID與真核啟動(dòng)子的TATA區(qū)域形成特異的DNA結(jié)合。TFIID由幾個(gè)蛋白組成，而其中的TATA區(qū)域結(jié)合蛋白（TBP），參與TATA序列的結(jié)合。TFIID的其他的蛋白組分被稱為TBP-相關(guān)因子（TAFs）。用TFIID探針寡核苷酸和HeLa細(xì)胞核抽提物，可得到一個(gè)微弱的凝膠遷移帶，但很難確定為是TFIID序列特異凝膠遷移復(fù)合物。純化的重組的TBP很難作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，這部分是由于TBP存在很強(qiáng)的正電荷，導(dǎo)致TBP/DNA復(fù)合物很難進(jìn)入凝膠。純化的TBP形成二聚體后不能結(jié)合DNA（17）。因此形成的二聚體可參與DNA結(jié)合。TF

18、IIB不單獨(dú)與DNA結(jié)合，但與TFIID結(jié)合后增強(qiáng)它與DNA的結(jié)合。TFIIB與預(yù)啟動(dòng)復(fù)合物結(jié)合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF結(jié)合到轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)。故TFIIB在預(yù)啟動(dòng)復(fù)合物的形成中有重要作用。當(dāng)用純化的TFIID作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，poly(dI-dC)不用加入結(jié)合反應(yīng)中。結(jié)合緩沖液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。對(duì)TFIID的凝膠結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的復(fù)合物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，凝膠組分是：0.5TBE, 6%聚丙烯酰胺凝膠(19:1丙烯酰胺:雙叉),4mMMgCl2,

19、0.02%NP-40, 電泳緩沖液組分是：0.5TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。當(dāng)研究含TFIID和TFIIB的復(fù)合物時(shí)，應(yīng)從結(jié)合緩沖液，凝膠，和電泳緩沖液中去除MgCl2。這些是一般的要求，用不同的細(xì)胞抽提物和TFIID、TFIIB形成復(fù)合物作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)對(duì)多種因素進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到理想的條件。8)在一次凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中，用多少量的蛋白質(zhì)或抽提物，和標(biāo)記的DNA探針？對(duì)每一個(gè)特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化，一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白：DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-

20、20ug蛋白形成特異的復(fù)合物。所加入反應(yīng)的探針的量是50，000-200，000cpm32P-標(biāo)記的探針（高特異活性），反應(yīng)體積為1-5ul。這相當(dāng)于10-50fmoles的DNA探針。探針應(yīng)保存在-20oC以防止降解，在合成或標(biāo)記后1-2個(gè)星期內(nèi)必需使用。無(wú)論探針或是結(jié)合蛋白應(yīng)避免多次凍融。9)能用體外翻譯法制備目的蛋白質(zhì)嗎？Promega沒(méi)對(duì)所有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作這類測(cè)試。一般，用麥胚抽提物作哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白的體外翻譯，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶裂解液可能含有內(nèi)源哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白。但TNT？/sup兔網(wǎng)織細(xì)胞溶解液系統(tǒng)（a,b,c,d）與TranscendTM 生物素標(biāo)記

21、的tRNA(目錄號(hào)E3201)一同使用，翻譯了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目錄號(hào)E3201）產(chǎn)生的遷移效果和重組的AP1相同（18）。TNT？/supT7偶聯(lián)的麥胚抽提物（b,c,d,e）在體外翻譯了c-Rel。這一蛋白特異地使免疫球蛋白k輕鏈增強(qiáng)子探針產(chǎn)生遷移。在c-Rel結(jié)合反應(yīng)中加入體外翻譯的MAD-3（IkB家簇中一員）可干擾其相互作用。10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA，特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結(jié)構(gòu)，可抑制蛋白對(duì)標(biāo)記探針的非特異結(jié)合，避免假?gòu)?fù)合物。 在凝膠遷移反應(yīng)中加入poly(dI:d

22、C)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，比如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的非特異結(jié)合。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時(shí)，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過(guò)50-100ng。對(duì)核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的非放射性的特異競(jìng)爭(zhēng)DNA或非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA時(shí)，作結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。一般，非放射性的特異DNA是非標(biāo)記的DNA探針，非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA ，長(zhǎng)度組成和DNA探針相同，序列不同。用非放射性的特異DNA能競(jìng)爭(zhēng)掉，而用非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA不能競(jìng)爭(zhēng)掉的

23、復(fù)合物，表明目的蛋白和同位素標(biāo)記探針的特異結(jié)合。非特異結(jié)合能用特異DNA和非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA競(jìng)爭(zhēng)掉。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作優(yōu)化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特異或非特異）的競(jìng)爭(zhēng)DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競(jìng)爭(zhēng)DNA通常是同位素標(biāo)記的探針的10-1000倍（w/w）。其他類型的競(jìng)爭(zhēng)DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝膠遷移反應(yīng)，它們會(huì)帶有目的蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。11)用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針?lè)蛛x開(kāi)？將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%（30：

24、1丙烯酰胺：雙叉），在特定條件下可用高或低的濃度。PH, 聚丙烯酰胺的濃度, 丙烯酰胺：雙叉丙烯酰胺的比會(huì)影響復(fù)合物在凝膠中的遷移。大多數(shù)蛋白用10-15伏的電壓，解離快的蛋白用短時(shí)間和高的電壓（30-35伏的電壓），電泳時(shí)所用的TBE和TAE必需是新配制的，無(wú)沉淀。低的離子強(qiáng)度和丙烯酰胺基質(zhì)的箱子效果有助于復(fù)合物的穩(wěn)定。也可將TGE緩沖液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物?？稍?oC進(jìn)行結(jié)合和電泳實(shí)驗(yàn)以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。加樣樣品液中的色素會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定復(fù)合物的解離，應(yīng)用不含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)的加樣樣品液。當(dāng)帶型不

25、緊密出現(xiàn)拖尾時(shí)，表明復(fù)合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復(fù)合物不進(jìn)入凝膠則表明所用的蛋白或探針過(guò)量，或鹽的濃度過(guò)量不適用于這一反應(yīng)。在含抽提液的帶中不含游離探針或復(fù)合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應(yīng)在抽提液中和結(jié)合反應(yīng)中加入相應(yīng)的抑制劑。目前可用高強(qiáng)度瓊脂糖凝膠分離蛋白/探針復(fù)合物（Metaphor?/sup/agarose）。12)如何在一個(gè)特定的復(fù)合物中確定一個(gè)蛋白質(zhì)的存在？部分純化的蛋白或粗制核抽提液和一個(gè)特定的探針可形成一個(gè)或幾個(gè)特異的蛋白復(fù)合物。多個(gè)復(fù)合物的存在表明蛋白降解，應(yīng)在制備抽提液的溶液中和結(jié)合反應(yīng)中加入蛋白酶抑制劑。確定復(fù)合物中蛋白

26、的特征可能會(huì)困難，但有一些方法作這方面的研究。如有目的蛋白的抗體，可進(jìn)行超遷移實(shí)驗(yàn)，抗體和蛋白/探針復(fù)合物中的蛋白結(jié)合，使復(fù)合物的遷移延遲，形成超遷移。增量的抗體加入到結(jié)合反應(yīng)中?？贵w可加入到蛋白和探針?lè)磻?yīng)后，也可將抽提物與抗體結(jié)合后，再加入探針。取決于抗體的特定的抗原決定簇，前者有利于超遷移復(fù)合物地形成，后者阻止復(fù)合物的形成導(dǎo)致原復(fù)合物的強(qiáng)度的減少。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)對(duì)抗體作滴定，先使抗體：蛋白的摩爾比為1：1，然后應(yīng)需要增加抗體的量。當(dāng)有純化的蛋白時(shí)，可用它們和實(shí)驗(yàn)的帶型遷移復(fù)合物比較。除超遷移實(shí)驗(yàn)外，復(fù)合物中蛋白的特征也可用UV交聯(lián)和標(biāo)記轉(zhuǎn)移來(lái)分析。在均質(zhì)標(biāo)記的探針和細(xì)胞核抽提物保溫后，

27、用UV照射使復(fù)合物交聯(lián)，隨后用DNA酶降解未保護(hù)的探針。需用均質(zhì)標(biāo)記的探針，因DNA酶會(huì)從末端標(biāo)記的探針中除去標(biāo)記。和保護(hù)的幾個(gè)核苷酸交聯(lián)的蛋白在變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離，干燥，放射自顯影。結(jié)合蛋白的分子量可和標(biāo)準(zhǔn)分子參照物比較。也可用目的蛋白的抗體對(duì)復(fù)合物作Western印跡分析（20）。如一個(gè)蛋白和DNA探針的特定序列結(jié)合，可用含保守結(jié)合序列的競(jìng)爭(zhēng)寡核苷酸，以及突變體來(lái)確定它的特征。也可用定點(diǎn)突變將保守序列結(jié)合位點(diǎn)改變來(lái)研究復(fù)合物的形成。參考資料1. Briggs M R et al 1986 Science 234, 472. Lee W et al 1986 Cell 49, 7

28、413. Williams T et al 1989 Genes Dev 2, 15574. Sen R and Baltimore D 1986 Cell 46, 7055. Parlsow T G et al 1984 Proc Natl Acad Sci USA 81, 26506. Montminy M R et al 1986 Proc Natl Acad Sci USA 83, 66827. Angel P et al 1987 Cell 49, 7298. Chiu R et al 1988 Cell 54, 5419. Rauscher F J et al 1988 Cell

29、52,47110. Imagawa M et al 1987 Cell 51, 25111. Berkowitz L A and Gilman M Z 1990 Proc Natl Acad Sci USA 87, 525812. Baeuerle P A 1991 Biochim Biophys Acta 1071, 6313. Duckett C S et al 1993 Mol Cell Biol 13, 131514. Urban M B et al 1991 EMBO J 10(7), 181715. Dynan W S and Tjian R 1983 Cell 35, 7916.

30、 Peterson M G et al 1990 Science 248, 165217. Coleman R A et al 1995 J Biol Chem 270, 1384218. Beckler G and Hurst R 1993 Promega Notes 43,2419. DiDonato, J A and Karin M 1993 Promega Notes 42, 1820. Demczuk S et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA90,2574使用了Promega 公司凝膠遷移實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品的參考資料1Xu J and Clark RAF 1997

31、 J Cell Biol 136, 473 (SP1和NFkB保守序列寡核苷酸）2 Dbaibo G S et al 1997 J Exp Med 185, 481（NFkB保守序列寡核苷酸）3 Pan Z K et al 1996 J Clin Invest 98, 2042（NFkB保守序列寡核苷酸）4 Kochekova M et al 1997 J Clin Invest 99, 3000（SP1保守序列寡核苷酸）5 Avantaggiati M L et al 1997 Cell 89, 1175（AP1保守序列寡核苷酸）6 Schmedite, J F et al 1997 J B

32、iol Chem 272, 601（NFkB保守序列寡核苷酸）7 Lee B S et al 1997 J Biol Chem 272, 174 （AP2和SP1保守序列寡核苷酸和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）8 Ohlsson B G et al 1997 J Clin Invest 98, 78（AP1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）9 In KH et al 1997 J Clin Invest 99, 1130（SP1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子） 植物基因工程表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化策略 植物基因工程表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化策略將特定的外源基因構(gòu)建在植物表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)入受體植物，并不是植物遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的。理想的轉(zhuǎn)基因植物往往需要外源基

33、因在特定部位和特定時(shí)間內(nèi)高水平表達(dá)，產(chǎn)生人們期望的表型性狀。然而，近二十年的發(fā)展歷史卻表明，外源基因在受體植物內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)表達(dá)效率低、表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物無(wú)法投入實(shí)際應(yīng)用。另外，轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題已在許多國(guó)家引起人們的關(guān)注，例如，轉(zhuǎn)基因有可能隨花粉擴(kuò)散，抗生素篩選標(biāo)記基因有可能使臨床上的某些抗生素失去作用等等。以上問(wèn)題的出現(xiàn)使得植物基因工程這一高新技術(shù)正處于一種前所未有的困擾時(shí)期。針對(duì)這些問(wèn)題，近幾年人們對(duì)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了多方面的探索和改進(jìn)，植物表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化就是其中最重要的一項(xiàng)內(nèi)容，本文就已經(jīng)取得的進(jìn)展進(jìn)行綜述。1 啟動(dòng)子的選用和改造外源基

34、因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問(wèn)題。目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來(lái)自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)自水稻的Actinl啟動(dòng)子。在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，

35、同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響，目前人們對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動(dòng)子主要包括器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。例如，種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子等。這些特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白基因的表達(dá)，由于該啟動(dòng)子可受水楊酸及其衍生物誘導(dǎo)，通過(guò)噴酒廉價(jià)、無(wú)公害的化學(xué)物質(zhì)，誘導(dǎo)抗蟲基因在蟲害重發(fā)生季節(jié)表達(dá)，顯然是一個(gè)十分有效的途徑

36、。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，使用天然的啟動(dòng)子往往不能取得令人滿意的結(jié)果，尤其是在進(jìn)行特異表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，表達(dá)水平大多不夠理想。對(duì)現(xiàn)有啟動(dòng)子進(jìn)行改造，構(gòu)建復(fù)合式啟動(dòng)子將是十分重要的途徑。例如，Ni等人將章魚堿合成酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)與甘露堿合成酶基因啟動(dòng)子構(gòu)成了復(fù)合啟動(dòng)子，GUS表達(dá)結(jié)果表示：改造后的啟動(dòng)子活性比35S啟動(dòng)子明顯提高。吳瑞等人將操作誘導(dǎo)型的PI-II基因啟動(dòng)子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進(jìn)行組合，新型啟動(dòng)子的表達(dá)活性提高了近10倍（專利）。在植物基因工程研究中，這些人工組建的啟動(dòng)子發(fā)揮了重要作用。2 增強(qiáng)翻譯效率為了增強(qiáng)外源基因的翻譯效率，構(gòu)建載體時(shí)一般要對(duì)基因進(jìn)行修飾，主要考

37、慮三方面內(nèi)容：2.1添加5-3-非翻譯序列許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真核基因的5-3-非翻譯序列（UTR）對(duì)基因的正常表達(dá)是非常必要的，該區(qū)段的缺失常會(huì)導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平顯著下降。例如，在煙草花葉病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻譯起始位點(diǎn)上游，有一個(gè)由68bp核苷酸組成的元件，這一元件為核糖體提供了新的結(jié)合位點(diǎn)，能使Gus基因的翻譯活性提高數(shù)十倍。目前已有許多載體中外源基因的5-端添加了翻譯增強(qiáng)序列。Ingelbrecht等曾對(duì)多種基因的 3-端序列進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)章魚堿合成酶基因的3-端序列能使NPTII基因的瞬間表達(dá)提高20倍以上。另外，不同基因的3-端序列增進(jìn)基因表達(dá)的效率有所

38、不同，例如，rbcS3-端序列對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用比查爾酮合酶基因的3-端序列高60倍。2.2 優(yōu)化起始密碼周邊序列雖然起始密碼子在生物界是通用的，然而，從不同生物來(lái)源的基因各有其特殊的起始密碼周邊序列。例如，植物起始密碼子周邊序列的典型特征是AACCAUGC,動(dòng)物起始密碼子周邊序列為CACCAUG，原核生物的則與二者差別較大。Kozak詳細(xì)研究過(guò)起始密碼子ATG周邊堿基定點(diǎn)突變后對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子周邊序列為ACCATGG時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對(duì)翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達(dá)載體的構(gòu)建中。例如，有一個(gè)細(xì)菌

39、的幾丁質(zhì)酶基因，原來(lái)的起始密碼周邊序列為UUUAUGG，當(dāng)被修飾為ACCAUGG，其在煙草中的表達(dá)水平提高了8倍。因此，利用非植物來(lái)源的基因構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)根據(jù)植物起始密碼子周邊序列的特征加以修飾改造。2.3對(duì)基因編碼區(qū)加以改造如果外源基因是來(lái)自于原核生物，由于表達(dá)機(jī)制的差異，這些基因在植物體內(nèi)往往表達(dá)水平很低，例如，來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達(dá)量非常低，研究發(fā)現(xiàn)這是由于原核基因與植物基因的差異造成了mRNA穩(wěn)定性下降。美國(guó)Monsanto公司Perlak等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下，對(duì)殺蟲蛋白基因進(jìn)行了改造，選用植物偏愛(ài)的密碼子，增加了GC含量，去除原序列

40、下影響mRNA穩(wěn)定的元件，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達(dá)量增加了30100倍，獲得了明顯的抗蟲效果。3 消除位置效應(yīng)當(dāng)外源基因被移人受體植物中之后，它在不同的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平往往有很大差異。這主要是由于外源基因在受體植物的基因組內(nèi)插入位點(diǎn)不同造成的。這就是所謂的位置效應(yīng)。為了消除位置效應(yīng)，使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，在目前的表達(dá)載體構(gòu)建策略中通常會(huì)考慮到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及定點(diǎn)整合技術(shù)的應(yīng)用。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix association region,MAR）是存在于真核細(xì)胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列。一般認(rèn)為，MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)哉

41、的邊界，其功能是造成一種分割作用，使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性，免受周圍染色質(zhì)的影響。有關(guān)研究表明，將MAR置于目的基因的兩側(cè)，構(gòu)建成包含MAR-gene-MAR結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，用于遺傳轉(zhuǎn)化，能明顯提高目的基因的表達(dá)水平，降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因表達(dá)水平的差異，減少位置效應(yīng)。例如，Allen等人研究了異源MAR（來(lái)自酵母）和同源MAR（來(lái)自煙草）對(duì)Gus基因在煙草中表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)酵母的MAR能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平平均提高12倍，而煙草本身的MAR能使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平平均提高60倍。使用來(lái)源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到同樣作用。另一可行的途徑是采用定點(diǎn)整合技術(shù)，這一技術(shù)的主要原理是，

42、當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有與寄主染色體同源的DNA片段時(shí)，外源基因可以通過(guò)同源重組定點(diǎn)整合于染色體的特定部位。實(shí)際操作時(shí)首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段，然后構(gòu)建植物表達(dá)載體。在微生物的遺傳操作中，同源重組定點(diǎn)整合已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，在動(dòng)物中外源基因的定點(diǎn)整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合以外，細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報(bào)道。4 構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體 為了克服細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達(dá)效率低，位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴(kuò)散而帶來(lái)的不安全性等問(wèn)題，近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)-葉綠體轉(zhuǎn)化，正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認(rèn)識(shí)并受到重視。到目前為止，已在煙草、水

43、稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發(fā)表）5種植物中相繼實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化，使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開(kāi)始成為植物基因工程中新的生長(zhǎng)點(diǎn)。由于目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測(cè)定，這就為外源基因通過(guò)同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組奠定了基礎(chǔ)，目前構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)整合載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)事例載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí)，一般都在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段（Targeting fragment）。當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過(guò)這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)。

44、在以作物改良為目的的葉綠體轉(zhuǎn)化中，要求同源重組發(fā)生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點(diǎn)處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)，保證了原有基因的功能不受影響。最近，Daniel等利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了一種通用載體（universal vector）。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者認(rèn)為這種載體

45、可用于多種不同植物的葉綠體轉(zhuǎn)化。如果這種載體的通用性得到證實(shí)，那么這項(xiàng)工作無(wú)疑為構(gòu)建方便而實(shí)用的新型葉綠體表達(dá)載體提供了一個(gè)好的思路。由于葉綠體基因組的高拷貝性，定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組的外源基因往往會(huì)得到高效率表達(dá)，例如McBride等人首次將Bt CryIA(c)毒素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，Bt毒素蛋白的表達(dá)量高達(dá)葉子總蛋白的3%5%，而通常的核轉(zhuǎn)化技術(shù)只能達(dá)到0.001%0.6%。最近，Kota等將Bt Cry2Aa2蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，也發(fā)現(xiàn)毒蛋白在煙草葉子中的表達(dá)量很高，占可溶性蛋白的2%3%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出2030倍，轉(zhuǎn)基因煙草不僅能抗敏感昆蟲，而且能夠百分之百地殺死那些產(chǎn)

46、生了高抗性的昆蟲。Staub等最近報(bào)道，將人的生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，其表達(dá)量竟高達(dá)葉片總蛋白的7%，比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出300倍。這些實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明，葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的重要途徑之一。 定位信號(hào)的應(yīng)用上述幾種載體優(yōu)化策略主要目的是提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，然而，高水平表達(dá)的外源蛋白能否在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉(zhuǎn)化中需要考慮的另一重要問(wèn)題。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘?hào)序列，使外源蛋白產(chǎn)生后定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位，例如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等，則可明顯提高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量。這是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域?yàn)槟承?/p>

47、外源蛋白提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等將擬南芥rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于殺蟲蛋白基因之前，發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白能夠特異性地積累在轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠體內(nèi)，外源蛋白總的積累量比對(duì)照提高了1020倍。最近，葉梁、宋艷茹等也將rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于PHB合成相關(guān)基因之前，試圖使基因表達(dá)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因油菜種子的質(zhì)體中積累，從而提高外源蛋白含量。另外，Wandelt等和Schouten等將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列（四肽KDEL的編碼序列）與外源蛋白基因相連接，發(fā)現(xiàn)外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的含量有了顯著提高。顯然，定位信號(hào)對(duì)于促進(jìn)蛋白質(zhì)積累有積極作用，但同一種定位信號(hào)是否適用于所

48、有的蛋白還有待于進(jìn)一步確定。 6 內(nèi)含子在增強(qiáng)基因表達(dá)方面的應(yīng)用內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的作用最初是由Callis等在轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)的，玉米乙醇脫氫酶基因（Adhl）的第一個(gè)內(nèi)含子（intron 1）對(duì)外源基因表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用，該基因的其他內(nèi)含子（例如intron8,intron9）也有一定的增強(qiáng)作用。后來(lái)，Vasil等也發(fā)現(xiàn)玉米的果糖合成酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子能使CAT表達(dá)水平提高10倍。水稻肌動(dòng)蛋白基因的第三個(gè)內(nèi)含子也能使報(bào)道基因的表達(dá)水平提高26倍。至今對(duì)內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的機(jī)制不不清楚，但一般認(rèn)為可能是內(nèi)含子的存在增強(qiáng)了mRNA的加工效率和mRNA穩(wěn)定性。Tanaka等人的多項(xiàng)研究表明，內(nèi)

49、含子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)作用主要發(fā)生在單子葉植物，在雙子葉植物中不明顯。 由于內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)有增強(qiáng)作用，Mcelroy等在構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體時(shí)，特意將水稻的肌動(dòng)蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子保留在該基因啟動(dòng)子的下游。同樣，Christensen等在構(gòu)建載體時(shí)將玉米Ubiquitin基因的第一個(gè)內(nèi)含子置于啟動(dòng)子下游，以增強(qiáng)外源基因在單子葉植物中的表達(dá)。然而，有研究指出，特定內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用取決于啟動(dòng)子強(qiáng)度、細(xì)胞類型、目的基因序列等多種因素，甚至有時(shí)會(huì)取決于內(nèi)含子在載體上的位置。例如，玉米Adhl基因的內(nèi)含子9置于Gus基因的5端，在CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下，Gus基因的表達(dá)未見(jiàn)增強(qiáng)；當(dāng)把內(nèi)

50、含子置于Gus基因3端，在同樣的啟動(dòng)子控制下，Gus基因的表達(dá)水平卻增加了大約3倍。由此可見(jiàn)，內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的作用機(jī)制可能是很復(fù)雜的，如何利用內(nèi)含子構(gòu)建高效植物表達(dá)載體，目前還缺乏一個(gè)固定的模式，值得進(jìn)一步探討。7 多基因策略迄今為止，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物。但有時(shí)由于單基因表達(dá)強(qiáng)度不夠或作用機(jī)制單一，尚不能獲得理想的轉(zhuǎn)基因植物。如果把兩個(gè)或兩個(gè)以上的能起協(xié)同作用的基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物，將會(huì)獲得比單基因轉(zhuǎn)化更為理想的結(jié)果。這一策略在培育抗病、抗蟲等抗逆性轉(zhuǎn)基因植物方面已得到應(yīng)用。例如，根據(jù)抗蟲基因的抗蟲譜及作用機(jī)制的不同，可選擇兩個(gè)功能互補(bǔ)的基因進(jìn)行載體構(gòu)建，并通過(guò)一

51、定方式將兩個(gè)抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)植物中去。王偉等將外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花，得到了含雙價(jià)抗蟲基因的轉(zhuǎn)化植株。Barton等將Bt殺蟲蛋白基因和蝎毒素基因同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草，其抗蟲性和防止害蟲產(chǎn)生抗性的能力大為提高（專利）。在抗病方面，本實(shí)驗(yàn)室藍(lán)海燕等構(gòu)建了包含-1，3-葡聚糖酶基因及幾丁質(zhì)酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入油菜和棉花，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株均產(chǎn)生了明顯的抗病性。最近，馮道榮、李寶健等將23個(gè)抗真菌病基因和hpt基因連在一個(gè)載體上，兩個(gè)抗蟲基因與bar基因連在另一個(gè)載體上，用基因槍將它們共同導(dǎo)入水稻植株中，結(jié)果表明，70%的R。代植株含有導(dǎo)入的全部外源基因（67個(gè)）

52、，且導(dǎo)入的多個(gè)外源基因趨向于整合在基因組的一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)。一般常規(guī)的轉(zhuǎn)化，尚不能將大于25kb的外源DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞。而一些功能相關(guān)的基因，比如植物中的數(shù)量性狀基因、抗病基因等，大多成基因簇的形式存在。如果將某些大于100kb的大片段DNA，如植物染色體中自然存在的基因簇或并不相連鎖的一系列外源基因?qū)胫参锘蚪M的同一位點(diǎn)，那么將有可能出現(xiàn)由多基因控制的優(yōu)良性狀或產(chǎn)生廣譜的抗蟲性、抗病性等，還可以賦予受體細(xì)胞一種全新的代謝途徑，產(chǎn)生新的生物分子。不僅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入還可以在一定程度上克服轉(zhuǎn)基因帶來(lái)的位置效應(yīng)，減少基因沉默等不良現(xiàn)象的發(fā)生。最近，美國(guó)的Hamilton和中國(guó)的劉