氨基酸薄層層析

1、如何分離鑒定氨基酸混合液？生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心氨基酸的薄層層析(Thin layer chromatography of amino acids)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握薄層層析法的一般原理。掌握薄層層析法的一般原理。 掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術(shù)。掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術(shù)。 掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（R Rf f值）來鑒定值）來鑒定 被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。層析基本概念層析基本概念 層析技術(shù)層析技術(shù)是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)（是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)（如溶解度、吸附能

2、力、分子形狀和大小、分子如溶解度、吸附能力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動(dòng)相各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動(dòng)相從固定相上流過，不同組分以不同速度而最終從固定相上流過，不同組分以不同速度而最終被分離。被分離。 特點(diǎn)：分離效率高，能分離各種性質(zhì)相類似的特點(diǎn)：分離效率高，能分離各種性質(zhì)相類似的物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分離純化，也可物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分離純化，也可用于大量物質(zhì)的分離純化和制備。用于大量物質(zhì)的分離純化和制備。層析基本概念層析基本概念 固定相固定相：固定相是層析的一個(gè)

3、基質(zhì)。包括：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。包括固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等）和液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素等）和液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。 流動(dòng)相流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為分離的物質(zhì)移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑層析時(shí)稱為展層劑。層析技術(shù)的分類層析技術(shù)的

4、分類（1）按兩相所處狀態(tài)，可分為液相層析和氣相層析）按兩相所處狀態(tài)，可分為液相層析和氣相層析，前者以液體為流動(dòng)相，后者以氣體為流動(dòng)相。，前者以液體為流動(dòng)相，后者以氣體為流動(dòng)相。（2）按操作形式不同，可分為柱層析、薄層層析和）按操作形式不同，可分為柱層析、薄層層析和紙層析。紙層析。（3）按層析的原理不同，可分為吸附層析、分配層）按層析的原理不同，可分為吸附層析、分配層析、凝膠層析、離子交換層析和親和層析等。析、凝膠層析、離子交換層析和親和層析等。今天要做的試驗(yàn)，根據(jù)原理屬于吸附層析，根據(jù)操作形式又屬于薄今天要做的試驗(yàn)，根據(jù)原理屬于吸附層析，根據(jù)操作形式又屬于薄層層析，合到一起叫：層層析，合到一起

5、叫：吸附薄層層析。吸附薄層層析。硅膠薄層層析硅膠薄層層析實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 1. 1.薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種 一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨由于吸附劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動(dòng)速率也不同，因混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。（

6、即通過吸附而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸解吸-再吸附再吸附-再解再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來）吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來）硅膠吸附薄層層析硅膠吸附薄層層析實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 吸附薄層中常用的吸附劑為吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠氧化鋁和硅膠 硅膠：表達(dá)式為硅膠：表達(dá)式為SiO2XH2OSiO2XH2O。層析用硅膠是一種。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性性硅醇基（硅醇基（Si SiOHOH），），這種極性的硅醇基能和這種極性的硅醇基能和許多化合物形成許多化合物形成氫鍵氫鍵而產(chǎn)生吸附而產(chǎn)生吸附. .

7、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)：硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)： 硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。硅醇基顯較弱的硅醇基顯較弱的酸性酸性，因而，硅膠只能用，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。分離。硅膠的活化溫度通常為硅膠的活化溫度通常為105105110110，不，不能過高。能過高。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 2. 氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)茚三酮水化后生成茚三酮水化后生成水化茚三酮水化茚三酮，它與氨基，它與氨基酸的羧基反應(yīng)生

8、成酸的羧基反應(yīng)生成還原茚三酮還原茚三酮、氨及醛，與、氨及醛，與此同時(shí)，還原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生此同時(shí)，還原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生成成紫紅化合物紫紅化合物而使氨基酸斑點(diǎn)顯色。而使氨基酸斑點(diǎn)顯色。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理3. 3.混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對(duì)遷移率用相對(duì)遷移率RfRf值（值（rate of flowrate of flow）來表示。）來表示。層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移的距離層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為與溶液前沿的距離之比為RfRf值。值。 由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定由于物質(zhì)在一定

9、溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動(dòng)速率（的，故移動(dòng)速率（RfRf值）也是恒定的，因此可值）也是恒定的，因此可以以根據(jù)根據(jù)RfRf值來鑒定被分離的物質(zhì)值來鑒定被分離的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 吸附劑：吸附劑：硅膠硅膠 粘合劑：粘合劑： 0.5%0.5%的羧甲基纖維素鈉的羧甲基纖維素鈉 氨基酸的異丙醇溶液氨基酸的異丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展開展開- -顯色劑顯色劑（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） 分析樣品：分析樣品：氨基酸混合液氨基酸混合液器器 材材 層析板、尺子、鉛筆層析板、尺子、鉛筆 燒杯、玻棒、量筒燒杯、玻棒、量筒 吹風(fēng)機(jī)吹風(fēng)機(jī) 毛細(xì)管、層

10、析缸毛細(xì)管、層析缸 藥匙藥匙 烘箱烘箱薄層層析裝置薄層層析裝置操作步驟操作步驟薄層板的制備薄層板的制備 層析板制備層析板制備2cm1cm Ala Arg Gly Mix輕觸疾起輕觸疾起操作步驟操作步驟點(diǎn)樣點(diǎn)樣點(diǎn)樣操作點(diǎn)樣操作操作步驟操作步驟 展層、顯色展層、顯色Ala Arg Gly Mix試樣展開過程試樣展開過程結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算 Rf =斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離溶劑前緣至原點(diǎn)距離溶劑前緣至原點(diǎn)距離 小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，計(jì)算出它們的離，計(jì)算出它們的 值。值。 根據(jù)根據(jù)值，鑒定出混合樣品中值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。Rf值測(cè)量值測(cè)量數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理樣品ArgGlyAla混合液斑點(diǎn)-原點(diǎn)溶劑前緣-原點(diǎn)Rf值注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1. 1.切勿用手直接接觸薄層板面。切勿用手直接接觸薄層板面。2. 2.點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。3. 3.