幾種三聚氰胺快速檢測方法比較

1、幾種三聚氰胺快速檢測方法比較2007年3月, 美國發(fā)生多起因食用寵物食品而導(dǎo)致寵物中毒死亡事件。2008 年9月, 中國發(fā)生因食用三鹿嬰幼兒奶粉導(dǎo)致嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥的嚴重事件。兩起事件的原因都是在食品或飼料中非法添加大劑量三聚氰胺。因此, 如何快速準確的分析食品和飼料中的三聚氰胺成為食品企業(yè)、食品管理機構(gòu)和廣大消費者密切關(guān)注的問題。   為科學(xué)合理地篩選快速、簡便、準確、經(jīng)濟的三聚氰胺檢測方法，中國計量院提出搭建快速檢測方法測試平臺的建議，并承擔了科技部應(yīng)急支撐項目“三聚氰胺快速檢測技術(shù)測試平臺的建設(shè)”。 該平臺啟動以來，以權(quán)威檢

2、測技術(shù)為支撐，以盲樣測試結(jié)果為依據(jù)，開展技術(shù)評價，在國內(nèi)首創(chuàng)“統(tǒng)一現(xiàn)場測試、統(tǒng)一評價方案、統(tǒng)一判別依據(jù)、統(tǒng)一專家評審、統(tǒng)一現(xiàn)場公布測試結(jié)果”的三聚氰胺檢測方法評價模式。以國際比對互認為基礎(chǔ)，建立乳與乳制品中的三聚氰胺氣相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法和液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法，為評價快速檢測方法奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。 為確保三聚氰胺檢測結(jié)果的有效性，全面提高檢測實驗室對原料乳及奶粉中三聚氰胺檢測能力水平，測試平臺先后組織實施了5輪全國三聚氰胺快速檢測技術(shù)方法的現(xiàn)場統(tǒng)一測試評價活動，共測試評價了56種檢測技術(shù)或方法，有效推出液相色譜法、拉曼光譜法、膠體金試免疫層析法（膠體金速測卡法）、酶聯(lián)免疫法(ELIS

3、A試劑盒法) 4種三聚氰胺快速檢測方法。   本文對常用的三種三聚氰胺快速檢測方法：液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫層析法的原理、特點做簡單介紹并對其應(yīng)用進行比較。 1. 液相色譜法      國家標準GB /T 22400􀀁2008公布了原料乳中三聚氰胺快速檢測的高效液相色譜法（HPLC法）, 采用乙腈作為原料乳中的蛋白質(zhì)沉淀劑和三聚氰胺提取劑, 0. 2 um微孔濾膜過濾后供HPLC 測定。采用的色譜柱

4、為強陽離子交換色譜柱, 流動相為乙腈􀀁緩沖液( 10 mmo l/L 檸檬酸, 10 mmo l/L辛烷磺酸鈉, 調(diào)節(jié)pH 至3. 0 ),采用紫外/二極管陣列檢測器檢測, 定量限為0. 3mg /kg, 定量靈敏度提高, 且分析時間較短。HPLC法雖然應(yīng)用普遍, 但存在一定的局限性, 樣品前處理過程復(fù)雜, 儀器昂貴,對檢測人員的要求高， 檢測成本高。 1.1 

5、;原理 用乙腈作為原料乳中的蛋白質(zhì)沉淀劑和三聚氰胺提取劑，強陽離子交換色譜柱分離，高效液相色譜-紫外檢測器/二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。 1.2 主要試劑和材料  乙腈（CH3CN）：色譜純。 1.2.2 磷酸（H3PO4）。 1.2.3 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。 1.2.4 三聚氰胺標準物質(zhì)（C3H6N6）：純度大于或等于99%。 1.2.5 三聚氰胺標準貯備溶液：1.00×103 mg/L。 1.3. 儀器 1.3.1 液相色譜儀：配有紫外檢測器/二極管陣列檢測器。 1.3.2&#

6、160;分析天平：感量0.0001 g 和0.01 g。 1.3.3 pH 計：測量精度±0.02 1.4 檢驗操作：按國標GB /T 22400􀀁2008要求操作。 2. 酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA)     酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是在免疫熒光和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)。其主要是利用抗原與抗體的高特異性反應(yīng)，通過合適的載

7、體，使酶標抗原或抗體與待測樣品反應(yīng)，形成酶標抗原抗體復(fù)合物，在相應(yīng)的酶底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使之水解成有色物質(zhì)。一定條件下，呈色物質(zhì)與待測物的含量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)呈色物質(zhì)顏色的深淺，對待測樣品進行定性定量分析。 近幾十年, 國內(nèi)外已建立了數(shù)十種藥物殘留的ELISA 分析技術(shù), 檢測水平可達ng 甚至pg水平。一些發(fā)達國家已經(jīng)研制成商品化的檢測試劑盒用于快速檢測。近十多年來我國也研發(fā)出多種商品化的檢測試劑盒用于快速檢測。 酶聯(lián)免疫吸附法具有特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、成本低，并可同時對大批量樣品進行快速檢測的特點，目前廣泛應(yīng)用于

8、食品中獸藥、毒素檢測的初篩中。 08年中國出現(xiàn)“三聚氰胺奶粉事件”時，主要使用的進口三聚氰胺速測試劑盒，現(xiàn)在國內(nèi)也已研發(fā)出商品化的三聚氰胺速測試劑盒，試劑盒靈敏度0.01ppm,最低檢測限為0.1ppm,已廣泛用于快速檢測。 2.1 原理 采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預(yù)包被三聚氰胺抗原，樣本殘留的三聚氰胺和微孔條上預(yù)包被的抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物三聚氰胺成負相關(guān)，與標準曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中三聚氰胺的含量。 2.2 主要試劑、材料  三聚氰胺ELISA檢測試劑盒 2.3 儀器

9、 2.3.1 獸藥殘留分析儀或酶標儀 2.3.2 分析天平：感量0.01g 2.4 檢驗操作：按三聚氰胺ELISA檢測試劑盒說明書要求操作。 3. 膠體金免疫層析技術(shù)     膠體金免疫層析技術(shù)（Colloidal Gold Immunochromatographic Assay ，GICA)是以膠體金為標記物的免疫層析技術(shù)，免疫層析( Immunochromatography, IC)技術(shù)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的快

10、速免疫分析方法。其原理是以條狀纖維層析材料為固相,借助毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動,同時,使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng),層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶) ,通過酶促顯色反應(yīng)或直接使用可目測的著色標記物(如膠體金) ,短時間(510min內(nèi))便可得到直觀的實驗結(jié)果。 膠體金免疫層析技術(shù)不需進行結(jié)合標記物與游離標記物的分離,省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟。因而這種分析技術(shù)操作簡單快速,分析結(jié)果清楚,易于判斷,且無須儀器。 膠體金免疫層析技術(shù)在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多,在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用在近幾年才

11、發(fā)展起來。國外在此方面起步較早,現(xiàn)在已經(jīng)有很多成熟的產(chǎn)品問世,國內(nèi)這幾年也發(fā)展較快，有多種應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品面世，三聚氰胺膠體金速測卡就是其中之一。 三聚氰胺膠體金速測卡檢測靈敏度高，結(jié)果直觀，操作方便、快捷，攜帶、儲存方便，成本低，非常適合于基層執(zhí)法部門對三聚氰胺的快速篩查。 3.1 原理   三聚氰胺膠體金速測卡的檢測原理是競爭性免疫層析。將著色標記物與待測抗原的特異性抗體(Ab1)相偶聯(lián),沉積在結(jié)合區(qū)。而檢測區(qū)處固相化的是待測抗原或待測抗原的類似物。若樣品中含有待測抗原,則樣品中的抗原和帶有標記物的Ab1形成Ag-Ab1復(fù)合物。隨后在通過固相

12、化有待測抗原或其類似物的檢測區(qū)時,由于競爭抑制,不再發(fā)生反應(yīng),檢測線處不顯色;樣品繼續(xù)前移, Ag- Ab1 復(fù)合物被固相化在質(zhì)控線處的抗Ab1 抗體(Ab2)所結(jié)合,形成Ab1- Ag- Ab2 復(fù)合物,使質(zhì)控線顯色。 3.2主要試劑、材料 三聚氰胺膠體金速測卡 3.3檢驗操作：按三聚氰胺膠體金速測卡說明書要求操作。 4. 三種三聚氰胺快速檢測方法的比較方法液相色譜法酶聯(lián)免疫吸附法膠體金免疫層析法儀器液相色譜儀獸藥殘留分析儀/酶標儀試劑（盒）色譜純試劑ELISA檢測試劑盒膠體金速測卡定性、定量定性、定量定性、半定量檢測靈敏度0.05ppm0.1ppm0.1ppm樣品前處理復(fù)雜