寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變

1、寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變 盒式誘變（Cassette Mutagenesis） 利用一段人工合成的含有突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列，從而達(dá)到定點(diǎn)突變的目的，稱為盒式誘變。實(shí)施盒式誘變時，要求靶DNA插入點(diǎn)兩側(cè)有合適的限制酶單一切點(diǎn)（圖45）。盒式誘變的例子 引物誘變（Primer Mutagenesis） 利用一段含有突變序列的寡核苷酸片段作為引物，經(jīng)DNA復(fù)制過程合成靶DNA片段，使其子代鏈發(fā)生突變，稱為引物誘變。 引物誘變的基本操作步驟：獲得單鏈目的基因；人工合成帶突變序列的引物；制備異源雙鏈DNA；轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；篩選重組體；突變基因的鑒定和回收 Kunkel誘變法（T

2、he Kunkel Mutagenesis Method） 這是1985年由Kunkel等人建立的一種寡核苷酸引物誘變法，該法的操作步驟如下：將復(fù)制型的M13噬菌體轉(zhuǎn)染到脫氧尿苷三磷酸酶和尿嘧啶脫糖苷酶雙缺陷的E. coli（dut-，ung-）菌株中生長，使U取代T摻入到DNA鏈中（一般每個重組體2030個）；以此種帶U的DNA鏈為模板，用帶突變堿基的寡核苷酸引物進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生異源雙鏈；將此異源雙鏈轉(zhuǎn)化到ung+菌株中生長，含U的模板鏈被破壞，從而使子代DNA鏈大部分（80%）含突變堿基序列 在dut+的E. coli中 dUTP酶 dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失體中（dut- ）

3、dUTP dUMP dut：dUTPase突變，可導(dǎo)致E.colidUTP的量增加，當(dāng)DNA復(fù)制時，可在很多應(yīng)該加dTTP的位置加入dUTP。 在正常情況下，尿嘧啶-糖基化酶(ung+)可以去除摻入DNA中的尿嘧啶殘基。但在ung-的菌株中，此酶失活。 在大腸桿菌dut- ung-菌株中生長的M13噬菌體的單鏈基因組DNA中將含有20-30個尿嘧啶殘基。用這些噬菌體感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA鏈遭到破壞，感染力下降約5個數(shù)量級。 此法的成功關(guān)鍵，是要得到此法的成功關(guān)鍵，是要得到好的含單鏈模板好的含單鏈模板DNADNA。 這種方法得到的突變率太低，約為1-5%。主要原因是含突變位點(diǎn)

4、的雙鏈DNA，轉(zhuǎn)入E.coli后，被其修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)了。快速引物誘變（QuikChange Primer Mutagenesis） 這是由Stratagene公司開發(fā)的一種引物定點(diǎn)誘變法，該法的操作步驟如下：將帶目的基因的重組體在dam+菌株中擴(kuò)增，使DNA序列被dam甲基化酶所修飾；使用帶突變堿基的寡核苷酸引物，在較高溫度下復(fù)制子代鏈，形成雙鏈突變體；用限制酶Dpn將帶甲基化標(biāo)記的親代雙鏈水解；將突變體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞限制酶位點(diǎn)消除引物誘變（Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Elimination） 限制酶位點(diǎn)消除引物誘變技術(shù)是一種利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常堿基所形成的DNA片段的特性，去除不含突變堿基的親代模板鏈，以提高定點(diǎn)突變效率的技術(shù)方法。 限制酶位點(diǎn)消除法的操作步驟是：將帶突變堿基的寡核苷酸引物與重組體單鏈模板退火后，加入硫代磷酸核苷酸衍生物進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生具有硫代磷酸核苷酸的異源雙鏈DNA；用特定的限制酶在此異源雙鏈DNA上作切口，此時親代模板鏈由于無硫代磷酸