泛素蛋白酶體及其抑制劑

1、泛素-蛋白酶體及其抑制劑沈子珒 許嘯聲 李稻審校上海交通大學醫(yī)學院 病理生理學教研室摘要：蛋白酶體與泛素化信號系統一起構成的泛素蛋白酶體（UPP）是哺乳動物細胞內主要的蛋白水解酶體系，參與和調控細胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶體是一個由20S催化顆粒、11S調控因子和2個19S調節(jié)顆粒組成的ATP依賴性蛋白水解酶復合體。蛋白酶體的活性狀態(tài)對細胞功能正常維持是非常重要的。26S蛋白酶體對蛋白的降解依賴于靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白識別。蛋白酶體抑制劑能通過抑制蛋白酶體活性進而干擾和影響細胞原有的功能，尤其對腫瘤細胞生長有明顯的抑制作用。同時，利用蛋白酶體抑制劑改變蛋白酶體的酶切位點活性也成為免疫、炎

2、癥等研究的熱點。蛋白酶體的抑制劑可分為天然化合物和合成化合物兩類，其中Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年研究較多的一種蛋白酶體抑制劑。關鍵詞：腫瘤 蛋白酶體 泛素 蛋白酶體抑制劑 PS-341泛素蛋白酶體通路（Ubiquitinproteasome pathway，UPP）的蛋白酶體（proteasome）是一種具有多個亞單位組成的蛋白酶復合體，蛋白酶體沉降系數為26S，故又稱26S蛋白酶體。蛋白酶體水解蛋白的前提是靶蛋白的泛素化。在UPP中，各種靶蛋白質泛素化后，先被26S蛋白酶體的19S亞單位識別，隨后泛素化靶蛋白脫泛素鏈和變性，進入20S亞單位的筒狀結構內被降解成3

3、22個多肽。由于蛋白酶體具有精確降解細胞內各種目的靶蛋白，進而參與基因轉錄和細胞周期調節(jié)，以及受體胞吞、抗原呈遞等各種細胞生理過程 1。因此，應用蛋白酶體抑制劑改變其酶切位點活性已成為抗腫瘤治療的研究熱點，蛋白酶體是影響和改變細胞功能重要的目的靶標。1蛋白酶體組成1979年，Goldberg等首先報道在大鼠肝臟和網織紅細胞中存在一種分子質量為700 kD的受ATP激活的中性蛋白水解酶。此后，一些在形態(tài)、功能及免疫學特征上與之相同的顆粒通過不同途徑被分離出來，被統一命名為蛋白酶體2。在真核生物進化中，蛋白酶體具有高度的保守性，其簡單形式甚至存在于古細菌和真細菌中。真核細胞內的蛋白酶體分布于胞質與

4、胞核內，有的與內質網或細胞骨架相結合，約占細胞蛋白質總量的1。有功能的26S蛋白酶體是由20S催化顆粒（catalytic particle, CP）、11S調控因子（11S regulator）和2個19S調節(jié)顆粒（regulatory particle, RP）組成，其分子量為2.4MD，是ATP依賴性蛋白水解酶復合體。1120S催化顆粒（20S CP） 人類蛋白酶體CP的沉降系數為20S，分子量700750kD。它由環(huán)和環(huán)組成，每個環(huán)各有7個相同的亞單位，分別以1-71-71-71-7順序排列成圓桶狀結構，20S CP中間由兩個亞單位環(huán)組成。幾乎所有亞單位都含有一個N 端前導序列，盡管此

5、序列在20S CP裝配過程中被切除，但在引導真核生物亞單位的正確折疊以及與亞單位的組裝中有重要作用3。當亞單位的N端前導序列被切除后，Thr殘基被暴露出來，Thr是酶的活性位點，分別存在于環(huán)的內表面，使亞單位具有類似的絲氨酸蛋白酶的催化作用4。例如，亞單位N端的折疊方式允許Thr的-OH對底物發(fā)動親核反應形成半縮醛，而Thr的-NH3可代替絲氨酸蛋白酶中His的咪唑基作為質子受體。此外，活性位點附近的一個Lys殘基與特定的絲氨酸蛋白酶中一樣，也起著催化劑的作用。目前認為，在20S CP內起催化作用的亞單位主要是b1、b2、b5。不同的亞單位的催化活性盡管不同，但能互相協調使蛋白酶體具有多種蛋白

6、酶活性，如類糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like, ChTL)、類胰蛋白酶活性（trypsin-like，TL）、肽-谷氨酰肽水解酶活性（post-glutamyl-peptide hydrolyzing，PGPH）、支鏈氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。在20S CP圓桶狀的兩端由亞單位環(huán)組形成，環(huán)口的中央被亞單位(1、2、3、6、7)的N末端肽鏈所占據，使環(huán)的外側完全關閉，阻止胞內非目的靶蛋白質進入20S CP內，而遭到降解破壞。不論在種間或種內，類亞單位遺傳特征均比類亞單位更為保守。1211S調控因子 在哺乳動物細胞內存在參與調控蛋白酶體功能的復合物，11S調控因子（REG

7、或PA28）是其中之一。11S調控因子的亞單位分子量為28KD，其亞單位分為：ERGa、ERGb、ERGg（Ki抗原）三種。亞單位的氨基酸序列大部分具有同源性，但17-34殘基為易變區(qū)，這也賦予亞單位的特異性。ERGa和ERGb可優(yōu)先形成一個七瓣形調控復合物11S調控因子5，并結合到20S CP末端，而ERGg不能與ERGa和ERGb結合形成11S調控因子。11S調控因子本身不具有催化和降解大分子蛋白的功能，但可激活蛋白酶體的蛋白酶活性，以及在促進抗原肽產生中起到重要的作用5。Wilk等人認為，ERGb低聚合體對蛋白酶體的活性有激活作用，而單體時卻是蛋白酶體的強有力抑制物6。1319S調節(jié)顆粒

8、（19S RP） 19S RP（19S調節(jié)復合物、19S帽或PA700）分別由20個亞單位組成，分子量為700KD，位于20S CP的兩端。從酵母到人類，19S RP的多數亞單位具有高度的保守性。19S RP形成蓋部 (1id)和基底部(base) 兩個亞復合體。19S RP基底部含有三倍體ATP酶亞基（RP triple ATPase, Rpt）和非ATP酶亞基（RP non- ATPase, Rpn），分子量在30110kD之間 7。6個Rpt亞基和2個Rpn亞基（Rpnl和Rpn2）組成的基底部位于CP的兩側， 6個Rpt亞基直接與20SCP的7個亞基結合在一起共同構成蛋白酶體。另外，R

9、pt有兩個有特殊作用：Rpt2 ATP酶參與打開環(huán)孔道；Rpt5 ATP酶參與識別泛素標記的蛋白質，這有利于引導展開的泛素化蛋白進入20SCP的環(huán)內。Strous等人認為，19S RP基底部能單獨降解小分子多肽和非泛素化蛋白，蓋部對蛋白酶體水解泛素化蛋白提供了高度的特異性保證8。另外，Romagnani等人研究發(fā)現，在Rpnl0或Rpn9基因缺失、突變的酵母株中，蓋部與基底部易發(fā)生脫落。這提示Rpn9和Rpnl0可能具有“合頁”樣的接納體(acceptor)作用8。所以，完整的26S蛋白酶體對ATP依賴的泛素化蛋白降解是必須的。 2泛素化靶蛋白識別靶蛋白（斷裂、氧化或衰老等引起的蛋白質損傷）的

10、泛素化是26S蛋白酶體降解蛋白的前提。但如何識別目的靶蛋白？目前為止，還知之甚少。但有人認為，在靶蛋白的泛素化過程中，對蛋白質F-box序列的識別是識別已磷酸化靶蛋白的前提。F-box是蛋白質間特異性相互作用的位點，具有F-box序列的蛋白質能夠特異性結合磷酸化的蛋白，同時，也是泛素連接酶復合體的主要成分 9。21 靶蛋白泛素化90年代初，人們發(fā)現細胞表面受體和配體結合引起的受體磷酸化與受體的泛素化降解過程密切相關10。許多細胞周期調節(jié)蛋白的泛素化受其自身磷酸化的調節(jié)，如細胞周期蛋白和細胞周期蛋白激酶的抑制蛋白、參與細胞信號傳導過程的調控蛋白（表面受體、轉運蛋白），以及一些轉錄調節(jié)因子（b-連

11、環(huán)蛋白、P53、Jun、RNA聚合酶等）11。靶蛋白的泛素化過程受遺傳控制，許多蛋白都具有自身特定的泛素化所需的氨基酸序列。Varshavsky等人首先發(fā)現重組p一半乳糖苷酶N一端存在降解決定序列，其泛素化的速度極大程度上依賴于N一端殘基的同一性12。此后，發(fā)現一些與泛素化降解相關序列具有親水性特征。但是，蛋白酶體對蛋白水解也有例外，如腫瘤抑制基因的RB蛋白能與人巨細胞病毒pp71蛋白結合在一起可通過非泛素化途徑進行蛋白酶體的蛋白水解13。22 靶蛋白脫泛素化 泛素化也是一個可逆的過程。已經發(fā)現真核細胞內存在多種脫泛素酶(DUB)，能夠水解泛素和蛋白質間的硫酯鍵。DUB可分為兩類：一類是泛素羧

12、端水解酶，水解泛素C端的連接小肽，也參與由泛素前體產生泛素單體的過程；另一類是泛素特異性加工酶，參與去除泛素化蛋白上的多聚泛素鏈，從而防止泛素化蛋白蓄積13。當蛋白酶體功能受抑制時，泛素化蛋白水解減少，蓄積的泛素化蛋白可出現脫泛素，如泛素化c-JNK激酶水解減少時，蓄積的泛素化c-JNK激酶可過脫泛素途徑使c-JNK激酶復活，結果導致c-Jun的磷酸化增加，從而增加核轉錄因子AP-1的DNA結合活性，使Fas表達增加13。3蛋白酶體抑制劑由于蛋白酶體活性狀態(tài)對細胞執(zhí)行不同的功能是非常重要的，因此蛋白酶體將成為影響細胞功能的重要藥物靶標，而其抑制劑有可能成為抗腫瘤的先導藥物14。實驗也證實，惡性

13、增殖細胞對蛋白酶體阻斷的敏感性比非腫瘤細胞更為強烈，如乳胞素(Lactacystin)對正常的淋巴細胞無明顯的作用。Masdehors等人發(fā)現B- CLL細胞中，ChTL活性水平是正常淋巴細胞的三倍，其蛋白的泛素化水平也高于正常細胞4。蛋白酶體的抑制劑可分為天然化合物和合成化合物兩類。31 天然化合物 311 3,4-二氯異香豆素 (DCI)DCI是絲氨酸蛋白酶的不可逆抑制劑。近來發(fā)現，DCI也能抑制20S CP幾種肽酶，如ChTL活性。由于DCI在抑制蛋白酶體的ChTL活性時，也能激活20S CP的酪蛋白酶活性和其他的肽酶活性，因此是一種選擇性較差的抑制劑15。312 乳胞素(Lactacy

14、stin)乳胞素是鏈霉菌屬的天然代謝物，是一種選擇性的20S CP抑制劑，具有抑制細胞周期和誘導神經母細胞分化的功能。乳胞素的活性位點可能涉及其內酰胺環(huán)上的甲基和異丁基側鏈上的第二個羥基15。乳胞素及其活性中間體的-內酯可選擇性和不可逆地結合于蛋白酶體的b5亞單位，從而抑制蛋白酶體多種肽酶活性，其中ChTL活性最先被抑制，TL和PGPH的活性抑制較慢，絲氨酸和酪氨酸蛋白酶活性則不受抑制。Qiao等人發(fā)現，乳胞素可以阻止動物和人類的結腸腫瘤形成，并通過脫氧膽酸抑制p53降解，導致核內p53積聚和相應的促凋亡基因的表達16。313 Aclacinomycin Aclacinomycin是一種Akl

15、avinone化學結構，抑制蛋白酶體的ChTL活性，對組織蛋白酶B無抑制效應，能激活胰島素，但對calpain作用范圍較小14。314 EponemycinEponemycin能以共價鍵方式結合到20S CP的 b5、b5i 和b1i亞單位，選擇性抑制蛋白水解酶活性，進而抑制ChTL活性。當Eponemycin濃度上升到50 nmol/L，也不抑制其他蛋白酶（calpain、組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶、胰島素、糜蛋白酶）的活性14。315 PR-39 PR-39是一種富含精氨酸/脯氨酸的多肽，它能可逆性與蛋白酶體的a7亞單位結合14。32 合成化合物 321 醛基肽醛基肽一類蛋白酶體抑制劑，其中

16、包括：MLN-519、MG-132、CEP- 1612、CVT-634等。多數醛基肽抑制劑可以抑制20S CP中ChTL活性，阻止蛋白酶體對泛素化蛋白的降解。隨后研究表明，此類蛋抑制劑的P2和P3位置均為疏水性氨基酸，如Ac-Leu- Leu-Nie-H和Z-Leu- Leu-Phe-H 。通過對Z-Leu-Leu -Xaa-H的研究表明，當P1位置為Leu或Phe（疏水性氨基酸殘基）時，其抑制活性最強。目前認為，MG-132（Z-leu-leu-leu-CHO，三肽基乙醛）作為蛋白酶體ChTL活性的可逆性抑制劑，同樣也能抑制組織蛋白酶和calpains作用。 另外，Desai等人在實驗中發(fā)現

17、，盡管MG132可以抑制喜樹堿誘導的拓撲異構酶I的下調，但也能使腫瘤細胞對喜樹堿的敏感性增加17。He等人提出，MG132能通過上調胞膜死亡受體-5與腫瘤壞死因子誘導的凋亡相關配體(tumor necrosis factor- related apoptosis- inducing ligand Apo2L- TRA IL)一起有效地促進Bax（）腫瘤細胞的凋亡18。近來，在HCT116細胞的實驗中發(fā)現，MG132可以使腫瘤細胞停滯于G2/M期，并以劑量依賴方式抑制細胞增殖和誘導凋亡19。MLN-519與b5亞基上Thr1的親核的Og反應。CEP-1612（二肽基乙醛）以可逆性加合物方式與b亞

18、基上Thr1的親核Og反應；同時，還具有抑制溶酶體和Ca2+依賴的蛋白酶活性。322 硼酸肽（二肽硼酸衍生物）硼酸肽是重要的蛋白酶體抑制劑。在體外細胞和動物體內實驗均表明有較強的蛋白酶體抑制活性，還具有高度的酶選擇性。Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年來研究較多的一種蛋白酶體抑制劑。Bonezomib作用于26S蛋白酶體的催化中心，與20SCP的亞單位環(huán)的Thr位點結合，能有效地抑制26S蛋白酶體的蛋白水解功能，阻斷UPP系統20。Bonezomib通過對20S CP亞單位不同位點結合，能選擇性地抑制一些特定蛋白的降解，使得細胞周期不能有序地進行，細胞周期停止于G2/M期

19、，最終導致ADP-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase）降解、核的固縮、細胞凋亡。Bonezomib對蛋白酶體的抑制作用是可逆的，在經過72小時處理后大多數蛋白酶體的活性都可以恢復正常。Bortezomib也是首個用于臨床研究的蛋白酶體抑制劑，在單獨或聯合其他藥物時，顯現出優(yōu)越的抗腫瘤作用和用藥的安全性。最近美國食品及藥品管理局（FDA）已批準Bortezomib用于治療耐藥的多發(fā)性骨髓瘤患者21、22。 2-aminobenzylstatine（硼酸衍生物）一個基于結構優(yōu)化處理和改進的蛋白酶體抑制劑。其中，NVP-AFB340的最具潛力靶點是ChTL，IC50值達

20、到7nmol/L。另外，NVP- AFD314等化合物也證實對PGPH和TL的活性有好的選擇性抑制，IC50值在小于20mmol/L14。323 其他Ritonavir（HIV-1蛋白酶抑制劑）通過與20S CP的b5、b5亞單位結合，抑制ChTL活性，是一種比較弱和低分子量抑制劑。乙烯砜三肽（三肽的乙烯砜部分）競爭性抑制物，對20S蛋白酶體的不同b亞單位具有較強的和特異性抑制作用，但也抑制胞漿cysteine蛋白酶。此外，金雀異黃素在體內、外實驗中均證實對蛋白酶體20S CP 的ChTL活性有抑制作用23。Koguchi等人發(fā)現TMC-95A及其異構體（B、C、D）可以高選擇性的抑制蛋白酶體

21、，作用于20S CP的ChTL、TL和PGPH活性基團24。除了蛋白酶體抑制劑具有抗癌作用外，可能在抗炎癥方面也顯示它的作用，因為許多炎癥介質也受蛋白酶體降解的影響。因此，蛋白酶體將成為了藥物發(fā)展過程中一個很具有前景的藥物靶標。參考文獻：1A Ciechanover, Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitinproteasome system and onto human diseases and drug targeting，Cell Death and D

22、ifferentiation, 2005; 12:117811902 Weissman A. Themes and variations on ubiquitylation. Nature Rev Mol Cell Biol, 2001; 2:169-l78.3 Coax O, Tanaka K, Goldberg A L,. Structure and function of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem, 1996; 65:801-847.4 Cezary W, Mario D N,. Ubiquitin-Proteasome

23、system and Proteasome Inhibition:New Strategies in Stroke Therapy. Stroke. 2004; 35:1506-1518. 5 Knowlton JR, Jolnston SC, Whitby FG, et al. Structure of the proteasome activator REGalpha (PA28alpha). Nature. 1997; Dec 11;390(6660):639-43.6 Wilke S, Chen WF, Magnusson RP,. Properties of the beta sub

24、unit of the proteasome activator PA28 (11S REG). Arch Biochem Biophys. 2000; Dec 1;384(1):174-80.7Schwartz A L, Ciechanover A,. The ubiquitin-proteasome pathway and pathogenesis of human diseases. Annu Rev Med, 1999; 50:57-74.8 Strous GJ，Govers RThe ubiquitinproteasome system and endocytosisCell Sci

25、 ,1999；112：1417-1423.9Skowyra, D., et al. (1997). F-box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex. Cell 91, 209-219.10Hicke LGettin down with ubiquitin：turn ing off cellsurface ，receptorstransporters and channelsTrends Ce ll Biol 1999；9：107-112

26、.11Koepp DM, Harper JW, EledgeSJ,How the cyclin became a cyclir：regulated proteolysis in the cell cycle. C 1999；97：431-434.12 Kwon YT, Kashina AS & Varshavsky A,. Alternative splicing results in differential expression, activity, and localization of the two forms of arginyl-tRNA-protein transfer

27、ase, a component of the N-end rule pathway. Mol Cell Biol 1999: 19:182193. 13Wilkinson, K. D., Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin. Cell Dev. Biol. . 2000; 11: 141-148.14 Julian A,. The proteasome: A suitable antineoplastic target. Canc

28、er, 2004; 4: 349-360.15 Skata N. Dixon JL,. Ubiquifin-proteasome-dependent degradation of apolipoprotein B100 in vitro J. Biochem Biophys Acta, 1999; 1437(1)：7I一79.16 Qiao D，Gaitonde SV，Qi w，et a1Deoxycholic acid suppresses p53 by stimulating proteasome-mediated p53 protein degradationCarcinogenesis

29、, 2001; 22(6):957-964.17 Desai SDLi TK，Rodriguez Bauman A，et a1 Ubiquitin26S proteasome-mediated degradation of topoisomerase I as a resistance mechanism to camptothecin in tumor cells. Cancer Res, 2001; 61(15):5926-5932.18 He Q，Huang Y, Sheikh MS,Proteasome inhibitor MGI32 upregulates death recepto

30、r 5 and cooperates with Apo2LTRAIL to induce apoptosis in Bax-proficient and deficient cells. Oncogene，2004; 23(14): 2554-2558.19 Kim OH，Lim JH，Woo KJ，et a1Influence of p53 and p21Waft expression on G2M phase arrest of colorectal carcinoma HCT116 cells to proteasome inhibitorsInt J Oncol, 2004; 24(4

31、): 935-941.20 Zavrski I, Jakob C,et al. Proteasome: an emerging target for cancer therapy. Anticancer Drugs, 2005 Jun; 16(5): 475-81.21 Vorhees PM，Dees EC，O Nell B，et a1. The proteasome as a target for cancer therapyClin Cancer Res, 2003; 9(17):6316-6325.22 Aghajanian CSoignet SDizon DSet a1A phase

32、I trial of the novel proteasome inhibitor PS341 in advanced solid tumor malignancies. Clin Cancer Res, 2002; 8(8):2505-2511.23 Kazi A，Daniel KGSmith DM，et a1 Inhibition of the proteasome activity, a novel mechanism associated with the tumor cell apoptosis-inducing ability of genistein Biochem Pharmacol, 2003; 66(6): 965-976.24 Koguchi Y，Kohno J，Nishio M，et a1 TMC-95A，B，Cand Dnovel proteasome inhibitors produced by Apiospora montagnei SaccTC 1093 Taxonomy，production，isolation，and biological activitiesJ Antibiot(Tokyo), 2000; 53(2):105-109.泛素-蛋白酶體及其抑制劑Ubiquitinproteasome and the