生物分離工程 第二章 細胞破碎

1、生物工程下游技術生物工程下游技術第二章第二章 細胞分離與破碎細胞分離與破碎3 3 學時學時學習目的和要求學習目的和要求 掌握解掌握解細胞分離細胞分離和和目標產物目標產物的釋放的的釋放的原理原理和方法，熟知各種方法的和方法，熟知各種方法的優(yōu)缺點優(yōu)缺點和應用范圍。和應用范圍。 目錄目錄n一、細胞分離一、細胞分離n（一）、重力沉降（一）、重力沉降n（二）、離心沉降（二）、離心沉降n（三）、過濾（三）、過濾n二、細胞破碎與胞內物釋放二、細胞破碎與胞內物釋放細胞分離學習要點細胞分離學習要點n識記：識記：重力沉降、離心沉降和過濾的概念。重力沉降、離心沉降和過濾的概念。n理解：理解：重力沉降、離心分離與過濾

2、原理、理重力沉降、離心分離與過濾原理、理論；掌握論；掌握StokesStokes（斯托克斯）沉降公式（斯托克斯）沉降公式 。n應用：應用：常用離心方法及優(yōu)缺點；利用掌握的常用離心方法及優(yōu)缺點；利用掌握的提高分離效率的方法分析決實際問題提高分離效率的方法分析決實際問題 （一）、重力沉淀n1、重力沉淀的定義n2、重力沉淀的理論n3 3、提高重力沉降的途徑、提高重力沉降的途徑1、重力沉降定義、重力沉降定義 重力沉降是傳統(tǒng)化工過程中常用的從含有固體重力沉降是傳統(tǒng)化工過程中常用的從含有固體顆粒的流體中將顆粒分離出來的操作。顆粒的流體中將顆粒分離出來的操作。 重力沉降重力沉降是利用流體與顆粒間的密度差，是

3、利用流體與顆粒間的密度差，在重力的作用下使顆粒與流體之間產生在重力的作用下使顆粒與流體之間產生相對運動，從而實現(xiàn)兩者的分離。相對運動，從而實現(xiàn)兩者的分離。 在生物分離過程中，定義中顆粒為細胞、細胞在生物分離過程中，定義中顆粒為細胞、細胞碎片等有形物碎片等有形物千姿百態(tài)的微生物世界千姿百態(tài)的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture2、重力沉降理論、重力沉降理論n理論假設理論假設n細胞或細胞碎片按照球形顆粒處理；細胞或細胞碎片按照球形顆粒處理；n顆粒在無限稀釋的溶液中進行沉降，顆粒顆粒在無限稀釋的溶液中進行沉降，顆粒之間無

4、相互干擾之間無相互干擾 n受力分析受力分析 球形顆粒重力球形顆粒重力fg 液體的浮力液體的浮力fb 顆粒運動方向相反的阻力顆粒運動方向相反的阻力 fs Fsd=2R球形顆粒沉降的受力情況球形顆粒沉降的受力情況重力沉降理論重力沉降理論gdfspg361gdfLpb3614222pgLSdvf重力：重力：浮力：浮力：阻力：阻力：sd,Ps分別指顆粒的直徑（m）和密度（kg.m-3）SedimentationFigure3.1 Schematic representation of separation of solids by setting重力沉降理論重力沉降理論當球形顆粒自身的重力與其所受到浮

5、力和阻力當球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力達到平衡時，達到平衡時， bSgfffgdvpLLSg342則則重力沉降理論重力沉降理論1Re103當球形顆粒處于滯流區(qū)（當球形顆粒處于滯流區(qū)（ ）時）時 Re24gdvLLSpg182Stokes公式公式當球形顆粒處于過渡區(qū)（當球形顆粒處于過渡區(qū)（ ）時）時 310Re15 . 0Re105 . 06 . 0Re27. 0LLSpggdvAllen公式公式當球形顆粒處于湍流區(qū)（當球形顆粒處于湍流區(qū)（ ）時）時53102Re1044. 05 . 074. 1LLSpggdvNewton公式公式千姿百態(tài)的微生物世界千姿百態(tài)的微生物世界Bacteri

6、al morphology diagramHigh-density cell culture球形顆粒？無限稀釋溶液？無限稀釋溶液？3 3、提高重力沉降的途徑、提高重力沉降的途徑n加入中性鹽：雙電層排斥電位降低雙電層排斥電位降低n加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大架橋作用形成大絮凝圖絮凝圖n引入外力引入外力PSAA)(F（二）、離心沉淀n1、離心沉淀的定義n2、離心沉淀的理論n3、離心分離方法n4、離心分離設備1、離心沉降定義、離心沉降定義離心沉降離心沉降是利用沉降設備使流體和顆粒旋是利用沉降設備使流體和顆粒旋轉，在離心力的作用下，由于顆粒和流體轉，在離心力的作用下，由于顆粒和流體間存在密度差，所

7、以顆粒沿徑向與流體產間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產生相對運動，從而使顆粒和流體分離。生相對運動，從而使顆粒和流體分離。 SuprenatantWet SolidsFigure 3.2 Schematic representation of centrifugal separationcentrifugation2、離心沉降理論、離心沉降理論rdvLLSPS2218)(離心沉降速度離心沉降速度 令：令：LLSPdS18)(2rSvS2gdvLLSpg1823、離心分離方法、離心分離方法n差速離心分級差速離心分級n區(qū)帶離心區(qū)帶離心 差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心 平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心 差速離心

8、分離差速離心分離 差速離心是以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心分離方法，應用某一特定顆粒沉淀的離心力在預定的離心時間內得到一部分顆粒沉淀及包含未沉淀顆粒的上清液。差速離心分離應用實例差速離心分離應用實例600g10 min15000g10 min100000g60 min300000g120 minnucleiMitochondrialysosomesPlasma membraneRiosomal subunitshomogenateFiltered homogenateSoluble part of cytoplasmSedimentation區(qū)帶離心分離前提區(qū)帶離心分離前提 在離心管內

9、的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同濃度（密度）的梯度介質（蔗糖等），按照濃度從大到小的原則，依次層層加入。加入離心管中的梯度介質經(jīng)高速離心或靜置后可形成連續(xù)的密度梯度。 操作過程操作過程區(qū)帶離心種類區(qū)帶離心種類n差速區(qū)帶離心(速度區(qū)帶離心）n平衡區(qū)帶離心（等密度離心）差差速速區(qū)區(qū)帶帶離離心心差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心n基于顆粒的大小、形狀的分離n梯度液的最大密度不能超過所分離顆粒的最大密度n離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等n動態(tài)離心分離方法平平衡衡區(qū)區(qū)帶帶離離心心平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心n梯度液密度范圍含蓋全部待分離顆粒密度n離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密

10、度相等n平衡離心分離方法梯度液的種類和應用梯度液的種類和應用細胞分離區(qū)帶離心異同細胞分離區(qū)帶離心異同區(qū)帶離心種類區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心共同點共同點事先在離心管內用低分子量溶質調配好密度梯度事先在離心管內用低分子量溶質調配好密度梯度梯度介質梯度介質常用蔗糖常用蔗糖常用氯化銫常用氯化銫密度梯度密度梯度最大的密度梯度低于最大密最大的密度梯度低于最大密度的沉降樣品度的沉降樣品最大的密度梯度大于最大密最大的密度梯度大于最大密度的沉降樣品度的沉降樣品區(qū)帶形成條件區(qū)帶形成條件根據(jù)各個組分沉降系數(shù)的差根據(jù)各個組分沉降系數(shù)的差別，形成各自的區(qū)帶別，形成各自的區(qū)帶根據(jù)各組分密

11、度差形成區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶離心條件離心條件在最前的沉降物質達到管底在最前的沉降物質達到管底前停止，短時間，低速度前停止，短時間，低速度使各組分沉降到其平衡的密使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高速度度區(qū)，長時間，高速度 離心方法新進展具體表現(xiàn)離心方法新進展具體表現(xiàn)在哪幾個方面？在哪幾個方面？n1.固定角轉子垂直管離心法的進展固定角轉子垂直管離心法的進展n使用垂直管轉子的成功之例是1980年由B. H. Chung等提高的血清脂蛋r白分離的SVs方法(即Single Vertical Spin法,一單次垂直管離心法)，它使對臨床診斷意義很大的這一分離在實用上成為可能.傳統(tǒng)的血清脂蛋

12、白分離用“順序浮選法”(即SF法)，一次分離需時3天，用去驅動壽命1億轉以上。現(xiàn)用垂直管轉子作SVS方法，不連續(xù)NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5萬一6.5萬轉/分，0.75-2.5 i)時，一次分離成功。n3.短液柱離心法短液柱離心法(Short-Column method)n由美國的0. M. Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平轉子中人為地使用不加滿的離心管來降低液柱高。此法不僅降低液柱高以減少離心時間，更重要的是使處千液面的樣品受到更大的離心力從而進一步縮短了離心時間，在不減少樣品量和樣品濃度的條件下，可把離心時間縮短為常規(guī)滿管離心時的一半或更少。

13、短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它們在不加滿離心時也不會變形。n4.細絕細絕(或細菌或細菌)的離心洗脫的離心洗脫(Flutriator) 技術技術n 這是美國Beckman公司近年發(fā)展的一種低速連續(xù)洗脫技術，特別適用于培養(yǎng)液的連續(xù)收集。使用的是帶小容量連續(xù)離心池的JE-6B轉子.其洗脫原理不是在一般轉子中的沉降，而是被分離物在離心中的“浮選”。用4. 2ml的離心池可在1小時內從100-1 000m!的原液中回收10-10，個細胞。n2.超速連續(xù)離心法超速連續(xù)離心法n超速連續(xù)離心轉子是由美國Beckman公司開發(fā)的，最適用于病毒的純化，從大量的組織勻漿中分離亞細胞組織、培養(yǎng)液中細菌的收集，

14、以及污水研究。4、離心設備分類、離心設備分類分類方法分類方法名稱名稱處理量處理量實驗室用離心機，工業(yè)用離心機實驗室用離心機，工業(yè)用離心機溫度溫度常溫離心機、冷凍離心機常溫離心機、冷凍離心機轉速轉速低速離心機、高速離心機、超速離心機低速離心機、高速離心機、超速離心機轉子結構轉子結構管式、碟式管式、碟式常用離心設備常用離心設備Solids-ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation Nozzle machine with pressurized solids discharg

15、e for yeast and bacteria separation 常用離心設備常用離心設備Decanter centrifuge Multichamber bowl, vertical cut 管式離心設備管式離心設備A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraperTubular bowl碟片離心設備碟片離心設備(a) Solids-retaining disk bowl, (b) Radial solids-ejecting disk bowl, top feed. (c) Radial s

16、olids-ejecting disk bowl, hermetic feed.(d) Axial solids-ejecting disk bowl. (e) Nozzle bowl with pressurized solids discharge. (f) Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.離心設備比較離心設備比較管式離心機管式離心機優(yōu)點優(yōu)點結構簡單，轉速和離心力較大結構簡單，轉速和離心力較大缺點缺點沉降面積小、處理能力低；沉降面積小、處理能力低；碟式離心機碟式離心機優(yōu)點優(yōu)點轉子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大轉子中存在隔板以

17、增大沉降面積，處理能力大缺點缺點結構復雜、轉速較低；結構復雜、轉速較低；離心機處理能力離心機處理能力粒子在徑向上的沉降速度粒子在徑向上的沉降速度 grvdtdrvgs2軸向移動速度軸向移動速度 2122rrQdtdzuz完全沉降的邊界條件完全沉降的邊界條件 0z1rr Lz 2rr 1222122lnrrgrrLvQg離心機處理能力離心機處理能力影響因素影響因素 處理樣品的特性，如密度、粒徑等處理樣品的特性，如密度、粒徑等 溶液的特性，如密度、粘度等溶液的特性，如密度、粘度等 離心機機械結構，如離心機機械結構，如r1和和r2 操作條件，操作條件， （三）、過濾n1、過濾的定義n2、過濾的受力分

18、析n3、提高過濾速度的途徑1、過濾定義、過濾定義過濾是利用多孔性介質（如濾布）截留過濾是利用多孔性介質（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法。離的方法。 過濾本身是一種膜分離技術。在分離細胞、菌體或過濾本身是一種膜分離技術。在分離細胞、菌體或它們的碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術也是它們的碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術也是一種常備的分離方法。一種常備的分離方法。2、過濾過程受力分析、過濾過程受力分析推動力：推動力：過濾操作以壓力差為主要推動力；過濾操作以壓力差為主要推動力； 阻阻 力：力：過濾過程的阻力來自多孔性過濾介過濾過程的

19、阻力來自多孔性過濾介 質和介質表面不斷堆積形成的濾餅質和介質表面不斷堆積形成的濾餅 過濾速率過濾速率cmLRRpAdtdQQ：液體的流量：液體的流量A:面積面積Rm表示介質的阻力；表示介質的阻力；Rc表示濾餅的阻力；表示濾餅的阻力；L為濾液的粘度為濾液的粘度 恒壓過濾方程恒壓過濾方程Ruth恒壓過濾方程恒壓過濾方程 020ttKQQ其中，其中，K為為Ruth恒壓過濾系數(shù)，表示為恒壓過濾系數(shù)，表示為SLLSccpAK1223、提高過濾速度的途徑提高過濾速度的途徑n采用絮凝或凝聚的方法預處理改變料液采用絮凝或凝聚的方法預處理改變料液的性質，降低濾餅阻力的性質，降低濾餅阻力n加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓

20、縮性指數(shù)，加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，提高過濾速度提高過濾速度 濾餅濾餅傳統(tǒng)的過濾cakeConventional filtrationfilterfilterfilterfiltratesolids recovery upon backflushFigure2.1 Schematic respresentation od s filter pressConceptual representation of plate and frame filterFlowsheet for continuous rotary vacuum filtrationwash spraysAir conne

21、ctioncakeContinuos rotary filter WashwaterpumpWashFiltratepumpMoisturetrap30AiroutDryvacuumpumpBarometricsealVacuumreceiversFigure 2.2 Flowsheet for continuous rotary vacuum filtration二、細胞破碎與胞內物釋放二、細胞破碎與胞內物釋放n1、概述n2、細胞破碎技術的分類n3、常用破碎方法的介紹學習要點學習要點n理解：理解：各種細胞破碎方法原理、優(yōu)缺點各種細胞破碎方法原理、優(yōu)缺點及其適用范圍。及其適用范圍。 n應用：應

22、用：采用不同的細胞破碎方法對不同采用不同的細胞破碎方法對不同細胞進行不同程度的破碎。細胞進行不同程度的破碎。 1、概述n（1）細胞結構n（2）細胞膜的組成n（3）影響產物釋放的因素（1）細胞結構）細胞結構 （真核細胞與原核細胞）（真核細胞與原核細胞）動物細胞動物細胞沒有細胞壁，只有由脂質和蛋白質組成的細胞膜沒有細胞壁，只有由脂質和蛋白質組成的細胞膜植物細胞植物細胞細胞膜外有一層堅固的細胞壁細胞膜外有一層堅固的細胞壁酵母細胞酵母細胞細胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質構成，更加難以破碎細胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質構成，更加難以破碎真核細胞真核細胞原核細胞原核細胞革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌細胞壁由肽

23、聚糖層組成，壁厚約細胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約1550 nm，肽聚糖含量為肽聚糖含量為4090%，細胞壁較革蘭氏陰性菌堅固。，細胞壁較革蘭氏陰性菌堅固。革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌細胞壁在肽聚糖的外側還有分別由（細胞壁在肽聚糖的外側還有分別由（1）脂蛋白和（）脂蛋白和（2）磷脂和脂多）磷脂和脂多糖構成的兩層外壁層，外壁層厚度越糖構成的兩層外壁層，外壁層厚度越810 nm。（2）細胞膜組成）細胞膜組成（A）（B）（3）影響產物釋放的環(huán)境因素）影響產物釋放的環(huán)境因素在復雜在復雜培養(yǎng)基培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細胞其破碎較單中生長的大腸桿菌細胞其破碎較單一培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細胞更難；一培養(yǎng)基中生長的大腸

24、桿菌細胞更難；對數(shù)對數(shù)生長期生長期的細胞會表現(xiàn)得更加脆弱。的細胞會表現(xiàn)得更加脆弱。從連續(xù)從連續(xù)培養(yǎng)過程培養(yǎng)過程中獲得的、具有較高比生長速率中獲得的、具有較高比生長速率的念珠菌的細胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠的念珠菌的細胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠菌體則有更加充裕的機會構建更加堅固的細胞壁。菌體則有更加充裕的機會構建更加堅固的細胞壁。酵母細胞壁的厚度和破碎阻力隨酵母細胞壁的厚度和破碎阻力隨年齡年齡增長而增加增長而增加經(jīng)常在幼酵母細胞中出現(xiàn)的經(jīng)常在幼酵母細胞中出現(xiàn)的芽痕芽痕（Bud scars）可引起酵母細胞局部細胞壁強度的降低可引起酵母細胞局部細胞壁強度的降低 2、細胞破碎技術的分類n細胞破

25、碎的目的 是釋放出細胞內含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分為機械法和非機械法兩大類。細胞破碎技術分類細胞破碎技術分類細胞細胞破碎破碎機械破碎機械破碎高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波破碎破碎非機械破碎非機械破碎物理法物理法滲透壓沖擊、凍結滲透壓沖擊、凍結-融化、融化、（超聲波）（超聲波）化學法化學法酸堿處理、化學試劑處理酸堿處理、化學試劑處理生物法生物法酶溶、自溶、噬菌體酶溶、自溶、噬菌體3、常用細胞破碎方法介紹（1）機械破碎高壓勻漿）機械破碎高壓勻漿細胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可細胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥桿之間的

26、環(huán)隙高速（可達到達到450 m/s）噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。用下破碎。 缺點：n這種方法較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器，質地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。 （2）機械破碎珠磨）機械破碎珠磨珠磨機的破碎室內填充有珠磨機的破碎室內填充有8085（v/v）的玻璃（密度為的玻璃（密度為2.5 g/ml）或氧化鋯（密度為或氧化鋯（密度為6.0 g/ml）的微球（粒徑約的微球（粒徑約0.

27、11.0 mm）。）。在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球與微球在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球與微球之間以及微球和細胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細之間以及微球和細胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。 缺點：n設備是珠后機，在珠波分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出，從而實現(xiàn)連續(xù)操作，破碎中，生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。存在的問題：操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗估計并且珠子之間的液體損失30左右。 （3）機械破碎撞擊破碎）機械破碎撞擊破碎撞擊破碎原理：撞擊破碎原理： 細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結（凍結速度為數(shù)細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結（凍結速度為數(shù)千千/min），），形成粒徑小于形成粒徑小于50 微米的微粒子，高速微米的微粒子，高速載氣（如氮氣，流速為載氣（如氮氣，流速為300m/s）將凍結的微粒子送將凍結的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結的細胞發(fā)生破入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結的細胞發(fā)生破碎。碎。 （4）機械破碎超聲波破碎）機械破碎超聲波破碎 壓電傳感器將電子振蕩器的交變電流轉換壓電傳感器將電子振蕩器的交變電流轉換為聲波