凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)(1)

1、編輯課件編輯課件生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗帶教帶教: 張學(xué)禮、戴薇薇張學(xué)禮、戴薇薇 龔張斌、黎志萍龔張斌、黎志萍編輯課件編輯課件實驗課要求實驗課要求 試劑用后及時歸位試劑用后及時歸位 及時記錄實驗結(jié)果及時記錄實驗結(jié)果 按時完成實驗報告按時完成實驗報告 離開時做好清潔工作離開時做好清潔工作編輯課件編輯課件實驗報告的書寫實驗報告的書寫標(biāo)題日期標(biāo)題日期一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康亩?、實驗原理二、實驗原理三、操作步驟三、操作步驟四、實驗結(jié)果四、實驗結(jié)果五、分析討論五、分析討論編輯課件編輯課件實驗基本操作實驗基本操作一、玻璃儀器的洗滌一、玻璃儀器的洗滌二、吸量管及微量取樣器的使用二、吸

2、量管及微量取樣器的使用三、溶液的混勻三、溶液的混勻四、離心機的使用四、離心機的使用編輯課件編輯課件實驗一實驗一 凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)1.掌握凝膠過濾層析法的基本原理；掌握凝膠過濾層析法的基本原理；2.掌握凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)的過程。掌握凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)的過程。一、一、 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康木庉嬚n件編輯課件二、二、 實驗原理實驗原理1. 常用生化實驗技術(shù)常用生化實驗技術(shù) 分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)電泳技術(shù)電泳技術(shù)離心技術(shù)離心技術(shù)層析技術(shù)層析技術(shù)編輯課件編輯課件2. 層析技術(shù)（色譜技術(shù)）層析技術(shù)（色譜技術(shù)） 是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)差異（吸附是利用混合物中各

3、組分的理化性質(zhì)差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力等）建立起來的技術(shù)。和力等）建立起來的技術(shù)。編輯課件編輯課件（1）層析系統(tǒng)的基本組成）層析系統(tǒng)的基本組成 固定相固定相 + 流動相流動相固體物質(zhì)固體物質(zhì) / 固定于固體物質(zhì)的成分固定于固體物質(zhì)的成分可以流動的物質(zhì)：可以流動的物質(zhì)：如水和各種溶媒如水和各種溶媒編輯課件編輯課件待分離混合物（待分離混合物（A、B）隨流動相通過固定相）隨流動相通過固定相 由于理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、由于理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含溶

4、解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同量對比）不同與固定相相互作用力與固定相相互作用力越弱越弱的組分，隨流動相移動時的組分，隨流動相移動時 受到的阻滯作用受到的阻滯作用小小，移動，移動速度快速度快分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分組分，從而達到將各組分分離分離的目的的目的編輯課件編輯課件（2 2）層析法的分類）層析法的分類 按兩相所處狀態(tài)分類按兩相所處狀態(tài)分類 流動相流動相液體液體氣體氣體固定相固定相液體液體液液液層析法液層析法氣氣液層析法液層析法固體固體液液 固層析法固層析法氣氣 固層析法固層析法編輯課件編輯

5、課件 按層析原理分類按層析原理分類 名稱名稱原理原理吸附層析法吸附層析法 固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力不同而分離劑表面吸附能力不同而分離分配層析法分配層析法 各組分在流動相和固相中的分配系數(shù)不同各組分在流動相和固相中的分配系數(shù)不同離子交換層離子交換層析法析法固定相是離子交換劑，各組分與離子交換固定相是離子交換劑，各組分與離子交換劑親和力不同而分離劑親和力不同而分離親和層析法親和層析法 固定相只能與一種待分離組分專一結(jié)合，固定相只能與一種待分離組分專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組分分離以此和無親和力的其它組分分離凝膠層析法凝膠層析法 固定

6、相是多孔凝膠，各組分的分子大小不固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同編輯課件編輯課件 按操作形式不同分類按操作形式不同分類 名稱名稱操作形式操作形式柱層析法柱層析法固定相裝于層析柱內(nèi)，使樣品沿著一個方固定相裝于層析柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達分離的層析法，包括一般柱層向前移而達分離的層析法，包括一般柱層析法、毛細管層析法和微粒填充柱層析法析法、毛細管層析法和微粒填充柱層析法平面層析法平面層析法層析過程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進行的層析過程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進行的層析法，包括紙層析法、薄層層析法和薄層析法，包括紙層析法、薄層層

7、析法和薄膜層析法膜層析法編輯課件編輯課件（3 3）層析技術(shù)的優(yōu)點）層析技術(shù)的優(yōu)點 分離效率高分離效率高 分析速度快分析速度快 具有極高的靈敏度具有極高的靈敏度 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣適用：適用： 雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析物樣品的分離分析編輯課件編輯課件3. 凝膠過濾層析法凝膠過濾層析法（gel filtration chromatography）（1 1）原理：）原理： 根據(jù)分子大小的差別進行分離。每個凝膠顆根據(jù)分子大小的差別進行分離。每個凝膠顆粒好象一個篩子，小分子物質(zhì)可以進入顆粒內(nèi)部，粒好象一個篩子，小分子物質(zhì)可以進

8、入顆粒內(nèi)部，大分子物質(zhì)被排阻在外。大分子物質(zhì)被排阻在外。 又名分子篩過濾，排阻層析又名分子篩過濾，排阻層析編輯課件編輯課件編輯課件編輯課件（2 2）凝膠的特點）凝膠的特點 屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍內(nèi)進行，不需要件較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍內(nèi)進行，不需要有機溶劑，對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果有機溶劑，對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。 交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠編輯課件編輯課件（3 3）凝膠的選擇）凝膠的選擇葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 (商品名商品名: Seph

9、adex，Dextran) 型號型號: G-10 G-200多孔網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)多孔網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)數(shù)字愈小數(shù)字愈小,交聯(lián)度越大交聯(lián)度越大,被篩分物質(zhì)的分子量也愈小被篩分物質(zhì)的分子量也愈小吸水能力，每吸水能力，每g干膠吸水量的干膠吸水量的10倍倍編輯課件編輯課件Sephadex G-50： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量分子量)為為: 1500 30000Sephadex G-200： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量分子量)為為: 5000 80000例：例：編輯課件編輯課件B. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 ( 商品名商品名: Sepharose , Bio- g

10、el A ) 對實驗條件要求高對實驗條件要求高 ( 溫度溫度, pH ) 40 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝膠工作的上限工作的下限是葡聚糖凝膠工作的上限, 用于大分子物質(zhì)的分離用于大分子物質(zhì)的分離編輯課件編輯課件C. 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 商品名商品名: Bio gel P（生物膠（生物膠P）編輯課件編輯課件三、實驗操作三、實驗操作1. 柱的選擇柱的選擇 直徑：直徑： 15 cm 一般長度：直徑一般長度：直徑 = 10：1 20：1 本實驗玻柱：本實驗玻柱： 直徑直徑0.8 1.5cm 長度長度 17 20cm編輯課件編輯課件2. 凝膠選擇、制備凝膠選擇、制備 血紅蛋白血紅蛋

11、白 溶菌酶溶菌酶 分離分離 （64500） （11400） 選擇選擇 Sephadex G-50Sephadex G-50： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量分子量)為為: 1500 30000編輯課件編輯課件制備：制備： 將干膠顆粒懸浮于將干膠顆粒懸浮于5 10倍的蒸餾水或洗脫液中倍的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去編輯課件編輯課件3. 凝膠裝柱凝膠裝柱柱固定于架子上，柱固定于架子上，垂直放置垂直放置，關(guān)住出口，關(guān)住出口自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使G-50 開始下沉，開始下沉，

12、 至至1 2cm時，打開出口時，打開出口凝膠逐層上升，至頂部凝膠逐層上升，至頂部 2-3cm時，關(guān)閉出口時，關(guān)閉出口編輯課件編輯課件注意點：注意點： 垂直放置垂直放置 防止氣泡產(chǎn)生防止氣泡產(chǎn)生 防止柱的分層防止柱的分層編輯課件編輯課件4. 平衡平衡放置一段時間，約放置一段時間，約40分鐘（使凝膠更好的壓實）分鐘（使凝膠更好的壓實）注意：注意：防止床面干涸，可適當(dāng)補充蒸餾水防止床面干涸，可適當(dāng)補充蒸餾水編輯課件編輯課件5. 加樣加樣 加樣前打開出口，使床面的蒸餾水流出，正好露加樣前打開出口，使床面的蒸餾水流出，正好露 出床面時，立即關(guān)閉出口出床面時，立即關(guān)閉出口（將干未干）（將干未干） 用滴管將

13、混合樣品用滴管將混合樣品(0.6ml，即血紅蛋白和溶菌酶，即血紅蛋白和溶菌酶 各各0.3ml)緩緩沿柱內(nèi)壁小心加于床表面緩緩沿柱內(nèi)壁小心加于床表面 打開出口，使樣品進入床內(nèi)，直到床面重新露出打開出口，使樣品進入床內(nèi)，直到床面重新露出, 立即加入立即加入12倍于樣品體積的蒸餾水倍于樣品體積的蒸餾水編輯課件編輯課件6. 洗脫洗脫當(dāng)此少量蒸餾水接近流干時，反復(fù)多次加入蒸當(dāng)此少量蒸餾水接近流干時，反復(fù)多次加入蒸 餾水，進行洗脫，直到兩帶分開餾水，進行洗脫，直到兩帶分開檢查檢查Hb在層析床中色帶位置，待在層析床中色帶位置，待Hb洗脫完后，洗脫完后， 用試管分步收集洗脫液用試管分步收集洗脫液 10d/管，每管加管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d 檢查溶菌酶洗脫情況，若為紫色，則為（檢查溶菌酶洗脫情況，若為紫色，則為（+）編輯課件編輯課件C Cu uS SO O4 4H2N - C - NH - C - NH2OO紫紫 紅紅色色堿堿性性縮二脲反應(yīng)縮二脲反應(yīng) （雙縮脲反應(yīng)）（雙縮脲