CCK操作說明和檢測步驟

1、DOJIND嗓作說明細(xì)胞活性檢測1. ?在 96?孔板中接種細(xì)胞懸液 ?（100 ml / 孔?） ?。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) ?（ 在37?C, 5% CO2的條件下?）。2. ?向每孔加入10 ml?的CCK- 8溶液?（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響？O.D值的讀數(shù) ）?。3. ?將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 ?1-4 小時(shí)。4. ?用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。5. ?如果暫時(shí)不測定 O.D值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入？10 ml 0.1 MHCI溶液或者1% w/vSDS?溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在？24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。細(xì)胞增殖 ?-毒

2、性檢測1. ?在 96?孔板中配制 ?100 ml 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) ?24小時(shí)?（?在37C，?5% CO2的條件下?）。2. ?向培養(yǎng)板加入 10 ml 不同濃度的待測物質(zhì)。3. ?將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 ?（例如: 6,12, 24? 或48小時(shí)?）4. ?向每孔加入10 ml CCK-8?溶液?（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響？0.D值的讀數(shù)）?。5. ?將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 ?1-4 小時(shí)。6. ?用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。7. ?如果暫時(shí)不測定 0.D值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入？10 ml 0.1 MHCI溶液或者1% w

3、/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在？24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加？CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基 中加入藥物后的空白吸收即可。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1. ?先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2. ?按比例 ?（?例如： 1/2 比例?）?依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般 要做 ?3-5 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組 3-6 個(gè)復(fù)孔。3. ?接種后培養(yǎng)2-4?小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加？CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定？0.D 值，制作出一條

4、以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo) ？（X軸）？，0.D值為縱坐標(biāo)？（Y軸）?的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量 ?（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入？CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間）DOJINDC檢測步驟CCK-8檢測步驟1. 向各孔中加入100卩l(xiāng)細(xì)胞懸液。a)2. 在37C下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b)3. 向各孔中加入各濃度的待測溶液c)10卩I4. 37 C下孵育。5. 向各孔中加入10卩I的CCK-8溶液d)6. 37 C下孵育1-4小時(shí)。e)7. 測定450 nm處的OD值。a) 使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制備 50,000-100,000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液b

5、) 建議使用CO2培養(yǎng)箱過夜預(yù)培養(yǎng)c) 使用培養(yǎng)基或PBS來制備溶液。d) 如果待測溶液有還原性，測定不含細(xì)胞，但含有CCK-8的待測溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8 ,如果吸光度相對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基， 并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的100卩l(xiāng)培養(yǎng)基和10 卩l(xiāng) CCK-8進(jìn)行檢測e) 白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長時(shí)間活力計(jì)算細(xì)胞活力* （%） =A（加藥）-A （空白）/A（0加藥）-A （空白）X 100A （加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A （空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度A （0加藥）：

6、具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度* 細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力問答：1. 一個(gè)孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞？當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000個(gè)/孔（100卩l(xiāng)培養(yǎng)基） 。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 （100u l培養(yǎng)基）。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并 按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10%加入CCK-8溶液。2. 能否用 384 孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的 CCK-8體積太少, 可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積 20

7、%的量。3. 能否用 24 孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。4. 酚紅會(huì)影響檢測嗎？不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消 去，因此不會(huì)對(duì)檢測造成影響。5. CCK-8 與胸苷結(jié)合檢測之間是否有相關(guān)性？有。然而，請(qǐng)注意由于 CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結(jié)果可能不6. CCK-8 能否檢測細(xì)菌細(xì)胞？可以檢測E.coli ，但不能檢測酵母細(xì)胞。向100卩I E.coli 培養(yǎng)液中加入10卩ICCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過夜。7. CCK-8 穩(wěn)定嗎？CCK-8在0-5 C下能夠保存至少 6個(gè)月，在-20

8、C下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20 C的儲(chǔ)藏條件。8. 如果沒有 450 nm 的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。9. 如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差?可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋 CCK-8試劑并混勻后加樣。10. CCK-8 是什么顏色？應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會(huì)影響測定。11. CCK8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色？不能。因?yàn)?CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽（WST8），并通過電子載體IMethoxy PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲 0也是高度水溶性的

9、，因此CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。12. CCK8檢測溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒？CCK8溶液自身因?yàn)楦邼舛鹊?IMethoxy PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。但是，加到培 養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因?yàn)楸幌♂屃?10倍。因此，長時(shí)間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在 CCK8檢測后還可以用于其他細(xì)胞增殖 檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測或者 DNA熒光檢測等。由于每種細(xì)胞對(duì)于 CCK8的 耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行長時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測一下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后 的活力。13. 在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對(duì)測定是否有影響？如何解決？有時(shí)會(huì)有影響。如果藥物具有還原性，會(huì)和CCK8發(fā)生顯

10、色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基（加CCK8的吸光度高，貝y證明藥物有影響，可在加 CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。14. 每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？可能會(huì)有以下幾個(gè)原因： 1. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干 燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不 作為測定孔用。2.有可能會(huì)因?yàn)镃CK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后, 輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。 請(qǐng)預(yù)先在1,0

11、00100,000 個(gè)/ 孔范圍內(nèi)摸索條件。15. 如何設(shè)定空白對(duì)照？在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入 CCK8培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定 450 nm的吸光度即為空 白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn) （細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) ） 時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞， 加入藥物的培養(yǎng)基中加入 CCK8培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定 450 nm的吸光度作為空白 對(duì)照。16. 哪些物質(zhì)會(huì)影響 CCK8的測定？當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響 CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等（一般 培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定）。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。17. 在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不

12、能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？可以縮短加入 CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入 CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為 1 小時(shí)。18. 設(shè)定參比波長的目的是什么？必須設(shè)定嗎？不一定要設(shè)定。 CCK-8 試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了取 出由于樣品混濁所帶來的吸收。19. 說明書上僅寫了 96孔板的測定方法，如果使用 24孔板貨 12孔板，應(yīng)該加多少量CCK-8試劑？一般情況下建議加入 CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。20. 在CCK-8顯色過程中，如何終止反應(yīng)？有一下幾種方法（96孔板）：1、在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4°C冰箱內(nèi)。2、每孔加10 口

13、 I 0.1 M HCL 溶液。3、每孔加10 口 I 1% （w/v）的SDS（十二烷基硫酸21. 必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？不一定。如果要向保持細(xì)胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)， 細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時(shí) 需要統(tǒng)一檢測條件。22. 如果加入的藥物中含有金屬，是否會(huì)有影響？金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為 1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5% 15% 90%勺顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 Mm的話，將會(huì)100%卬制。23. CCK-8 試劑的保存條件？在避光條件下 CCK-8試劑在4C可保存一年。如果需要保存

14、較長時(shí)間的話，推薦在-20 C下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在 4C冰箱內(nèi)保存24. 預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？一般情況下用胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì) 數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。25. CCK-8 對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入 CCK-8 培養(yǎng)1-4 小時(shí)吸光度已經(jīng)很高， 但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低， 可以通過延長 CCK-8 的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。26. 懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染 色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過大，有時(shí)吸光度會(huì)超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。27. 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對(duì)于狀態(tài)不一樣的 細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì)有輕微的差異， 對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。28. 有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，