內(nèi)毒素及β-葡聚糖檢測

1、內(nèi)毒素和內(nèi)毒素和1，3-D-葡葡聚糖檢測的臨床應(yīng)用聚糖檢測的臨床應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容來源及結(jié)構(gòu)生物學(xué)活性檢測的臨床應(yīng)用檢測方法及參考范圍標本采集及影響因素 內(nèi)內(nèi) 毒毒 素素內(nèi)毒素的生物學(xué)活性內(nèi)毒素的生物學(xué)活性發(fā)熱反應(yīng)發(fā)熱反應(yīng)1激活血管活性物質(zhì)的釋放激活血管活性物質(zhì)的釋放2激活凝血和纖溶系統(tǒng)激活凝血和纖溶系統(tǒng)3激活補體激活補體4直接或間接損害肝臟直接或間接損害肝臟5激活白三烯、前列腺素及單核巨噬系統(tǒng)激活白三烯、前列腺素及單核巨噬系統(tǒng)6內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)特異性多糖特異性多糖核心多糖核心多糖類脂類脂A A外層外層菌體多糖（菌體多糖（O O抗抗原），與細菌侵原），與細菌侵襲力有關(guān)。襲力有關(guān)。中層

2、中層同一種屬之間是同一種屬之間是相同的。相同的。內(nèi)層內(nèi)層特殊的糖磷脂，特殊的糖磷脂，起毒性作用，而起毒性作用，而無種屬特異性。無種屬特異性。內(nèi)毒素概述內(nèi)毒素概述 內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)中的脂多糖（LPS），這些成分只在細菌死亡裂解后才釋放到菌體外或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。內(nèi)毒素的有益作用內(nèi)毒素的有益作用增加機體非特異性免疫力增加機體非特異性免疫力1防御放射性損傷，促進粒細胞生成防御放射性損傷，促進粒細胞生成2增加網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能增加網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能3抗腫瘤，免疫佐劑作用抗腫瘤，免疫佐劑作用4內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生原因內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生原因內(nèi)毒素血癥內(nèi)毒素血癥內(nèi)源性內(nèi)源性外源性外源性腸道內(nèi)毒素的吸

3、收腸道內(nèi)毒素的吸收1敗血癥時血中細菌的釋放敗血癥時血中細菌的釋放23有效的抗菌治療后，細菌崩解有效的抗菌治療后，細菌崩解輸入了含有輸入了含有細菌的藥物、細菌的藥物、血液或者體血液或者體液等。液等。各類疾病內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率各類疾病內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率 肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、燒傷85%、急性胰腺炎90%、敗血癥70%、急性肝炎37-64%、暴發(fā)性肝炎58-100%、丙肝60%、膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%、多器官功能衰竭100%。內(nèi)毒素檢測的臨床應(yīng)用內(nèi)毒素檢測的臨床應(yīng)用在肝膽疾病中的應(yīng)用在肝膽疾病中的應(yīng)用1在呼吸系統(tǒng)感染中的應(yīng)用在呼吸系統(tǒng)感染中的應(yīng)用2在胰

4、腺疾病中的應(yīng)用在胰腺疾病中的應(yīng)用3在潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用在潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用4在全身性細菌感染中的應(yīng)用在全身性細菌感染中的應(yīng)用5在不明原因發(fā)熱中的應(yīng)用在不明原因發(fā)熱中的應(yīng)用6內(nèi)毒素檢測在醫(yī)院中的應(yīng)用內(nèi)毒素檢測在醫(yī)院中的應(yīng)用在醫(yī)院滅菌制劑檢驗中應(yīng)用在醫(yī)院滅菌制劑檢驗中應(yīng)用1對注射器、輸液器等醫(yī)療器械的內(nèi)毒素檢測對注射器、輸液器等醫(yī)療器械的內(nèi)毒素檢測2在透析站和血站中的應(yīng)用在透析站和血站中的應(yīng)用3在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用4內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀v內(nèi)毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對內(nèi)毒素的抵抗力。v癥狀和體征有：發(fā)熱，白細胞數(shù)變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減

5、退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以及休克、血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。 最嚴重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率極高。內(nèi)毒素的檢測方法內(nèi)毒素的檢測方法1.凝膠法：鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量內(nèi)毒素的方法2.濁度法：利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量3.比色法：利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量4.流式細胞術(shù)：測內(nèi)毒素的量而不是活性5.化學(xué)發(fā)光測定法內(nèi)毒素的檢測原理v革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒（光度法）革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒（光度法）v檢測原理：革蘭陰性菌脂多

6、糖能激活酶反應(yīng)主檢測原理：革蘭陰性菌脂多糖能激活酶反應(yīng)主劑中的劑中的C C因子、因子、B B因子、凝固酶原等，引起凝固因子、凝固酶原等，引起凝固蛋白原轉(zhuǎn)變成凝固蛋白從而引起吸光度變化，蛋白原轉(zhuǎn)變成凝固蛋白從而引起吸光度變化，根據(jù)檢測其溶液吸光度變化對革蘭陰性菌脂多根據(jù)檢測其溶液吸光度變化對革蘭陰性菌脂多糖濃度進行測定。糖濃度進行測定。 MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)內(nèi)毒素檢測的參考值內(nèi)毒素檢測的參考值v檢測值10pg/ml,陰性。v檢測值介于1020pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。v檢測值20pg/ml，陽性，建議臨床結(jié)合癥狀進行治療。 檢測方法的局限性檢

7、測方法的局限性v只能檢測革蘭陰性菌脂多糖含量，不能區(qū)分細只能檢測革蘭陰性菌脂多糖含量，不能區(qū)分細菌種屬。菌種屬。 檢測樣本的采集與保存檢測樣本：血液檢測樣本：血液采集要求：采樣過程要求無菌操作，用專用的無采集要求：采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管（肝素類抗凝）。常規(guī)病人早熱原真空采血管（肝素類抗凝）。常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血上用藥治療前空腹采血/ /取樣（血透患者透析前取樣（血透患者透析前采血）。采血）。樣本保存：樣本采集后應(yīng)在樣本保存：樣本采集后應(yīng)在30003000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分進行離心，分進行離心，若不能及時檢測，應(yīng)將血漿轉(zhuǎn)移至無熱原試管若不能及時檢測，應(yīng)將血漿轉(zhuǎn)移至無熱

8、原試管內(nèi)，在內(nèi)，在-30-30冰箱中冷凍保存，一周內(nèi)使用。冰箱中冷凍保存，一周內(nèi)使用。特殊標本處理特殊標本處理 ：對一般黃疸、溶血、乳糜血標本，：對一般黃疸、溶血、乳糜血標本，稀釋稀釋2 2- -5 5倍后進行檢測倍后進行檢測 ；對于嚴重的黃疸、溶；對于嚴重的黃疸、溶血、乳糜血標本，應(yīng)重新采血。血、乳糜血標本，應(yīng)重新采血。干擾因素1.1.應(yīng)用某些抗生素如應(yīng)用某些抗生素如-酰胺內(nèi)酯類、喹諾酮類酰胺內(nèi)酯類、喹諾酮類等患者；等患者；2.2.一些蛋白：陽離子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶一些蛋白：陽離子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶A A及人免疫球蛋白及人免疫球蛋白G G均能與內(nèi)毒素形成細菌內(nèi)毒均能與內(nèi)毒素形成細

9、菌內(nèi)毒素素-蛋白復(fù)合體，對細菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽蛋白復(fù)合體，對細菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用，而影響測定內(nèi)毒素結(jié)果；作用，而影響測定內(nèi)毒素結(jié)果；3.3.操作環(huán)境及操作過程中的污染，可能造成假陽操作環(huán)境及操作過程中的污染，可能造成假陽性。性。(1-3)- -D-葡聚糖葡聚糖1-3-D-1-3-D-葡聚糖本質(zhì)及特點葡聚糖本質(zhì)及特點真菌細胞壁成分，占真菌細胞壁成分，占50%以上以上1其他微生物、動物及人的細胞不含該成分其他微生物、動物及人的細胞不含該成分2用于侵襲性真菌感染的早期診斷用于侵襲性真菌感染的早期診斷3(1-3)-D-(1-3)-D-葡聚糖特性葡聚糖特性1.對熱極為穩(wěn)定，高壓21并不能使其滅活

10、。在念珠菌和曲霉菌細胞壁中含量較多，對G試驗靈敏。2.2.當真菌進入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-D-葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中含量增高。當真菌在體內(nèi)含量減少時，機體免疫系統(tǒng)可將其清除。3.3.在淺部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被釋放出來，故其在體液中的量不增高。侵襲性真菌感染的定義侵襲性真菌感染的定義 侵襲性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)定義 指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜、肌肉和內(nèi)臟器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性較大。侵襲性肺部真菌感染v侵襲性真菌感染的發(fā)病率逐年上升,其中又

11、以侵襲性肺部真菌感染最常見,大約占50%60%。未經(jīng)及時治療的肺部真菌感染患者的病死率可高達30% 80% 。侵襲性肺部真菌感染v臨床表現(xiàn)：缺乏特異性,多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咳血、胸悶、呼吸困難等。 現(xiàn)狀：兩高兩低一快 高院內(nèi)感染率和病死率，低臨床和實驗 室診斷率，患者病情惡化快。 （檢測方法相對滯后,早期診斷和治療仍存在困難,副作用小的新型抗真菌藥物價格昂貴,導(dǎo)致病死率高。）侵襲性真菌感染的誘因侵襲性真菌感染的誘因v內(nèi)源性誘因： 影響機體抵抗力的各種疾病，如白血病、癌癥、結(jié)核、肺膿腫、糖尿病、肝臟疾病以及維生素缺乏等。v外源性誘因： 侵襲性真菌感染侵襲性真菌感染診斷困難的原因l 診斷困難

12、的主要原因：v臨床表現(xiàn)不典型，易被基礎(chǔ)疾病所掩蓋v確診常需侵入性手段獲得組織標本，侵入性操作常因患者的病情所限難以實施v真菌檢測項目開展相對不足或滯后0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%80.00%90.00%100.00%各種真菌感染的病死率29.50%73.50%90%83%96%58%侵襲性念珠菌病 侵襲性曲霉菌病粒細胞缺乏患者曲霉菌感染鐮刀菌屬感染 播散性接合菌病 賽多孢菌屬感染系列129.50%73.50%90%83%96%58%侵襲性真菌感染的特點侵襲性真菌感染的特點v不產(chǎn)生內(nèi)毒素和外毒素，致病機理不明；v致病力一般較弱，機

13、體免疫低下時發(fā)生；v感染菌種變化：白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增長趨勢上升明顯；v早期癥狀無特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高。主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病肺炎、肺纖維癥肺結(jié)核、腹腔內(nèi)膿腫、AIDS腦出血、腦梗塞、硬膜下血瘤術(shù)后、胸部大動脈瘤術(shù)后糖尿病再生障礙性貧血、DIC胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤“G”試驗v1-3-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。G試驗檢測評價vBG值在侵襲性真菌感染臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已經(jīng)高于正常值u相關(guān)報道5例確診IFI及3例臨床診斷的IF

14、I患者，發(fā)現(xiàn)BG值升高出現(xiàn)在發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀和肺部CT檢查發(fā)現(xiàn)以前 。u平均早于發(fā)熱5du早于呼吸道癥狀10dG試驗臨床應(yīng)用 1明確診斷（抗真菌藥物治療前）2治療效果監(jiān)測（抗真菌藥物治療后）3連續(xù)2次采血進行G試驗侵襲性真菌感染的臨床檢測方法v直接培養(yǎng)真菌法-敏感性低，耗時長, 培養(yǎng)陽性率低。培養(yǎng)結(jié)果是定性的，有些標本采集困難vG試驗：通過檢測(1-3)-D-葡聚糖的含量，判斷是否有真菌感染。耗時短，靈敏度高，特異性強，定量檢測可判斷感染嚴重程度vPCR技術(shù)：真菌的抗原、抗體及代謝產(chǎn)物的血清學(xué)檢查和真菌核酸檢測真菌1-3-D葡聚糖檢測原理v真菌1-3-D葡聚糖檢測試劑盒（光度法）v檢測原

15、理：真菌1-3-D葡聚糖能特異性激活反應(yīng)主劑中的G因子、凝血酶原等，發(fā)生酶的級聯(lián)反應(yīng)從而引起吸光度變化，根據(jù)檢測其溶液吸光度變化對真菌1-3-D葡聚糖濃度進行定量。 試劑中添加的兩性電解質(zhì)甘氨酸、氨基糖苷類抗生素及表面活性劑可抑制脂多糖對B、C因子的激活，對革蘭陰性菌脂多糖有特異性屏蔽作用。MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)真菌1-3-D葡聚糖參考值v檢測值60pg/ml,陰性。v檢測值介于60100pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。v檢測值100pg/ml，陽性(深部真菌感染)，建議臨床結(jié)合癥狀進行治療。檢測方法的局限性v只能檢測真菌1-3-D葡聚糖的含量，不

16、能區(qū)分真菌種屬，不能檢測結(jié)合菌和隱球菌。內(nèi)毒素與內(nèi)毒素與-葡聚糖的檢測比較v已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細菌內(nèi)毒素和真菌1-3-D葡聚糖，但它們的反應(yīng)曲線不一樣。內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，而-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點的斜線。念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色對于念珠菌血癥, G試驗檢測是首選檢查v 熱帶念珠菌熱帶念珠菌-灰藍色灰藍色v 白色念珠菌白色念珠菌 -綠色綠色v 克柔念珠菌克柔念珠菌-粉紅色粉紅色v 光滑念珠菌光滑念珠菌-紫紅色紫紅色標本采集及保存v檢測樣本：血液、肺細胞灌洗液檢測樣本：血液、肺細胞灌洗液v采集要求：采集要求： 1. 1.采樣過程要求無菌操作，用

17、專用的無熱采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管；原真空采血管； 2. 2.常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血，血常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血，血透析患者透析前采血透析患者透析前采血標本采集及保存v及時送檢，及時檢測：及時送檢，及時檢測：2-3h2-3h內(nèi)檢測內(nèi)檢測v不合格標本：嚴重黃疸、溶血、乳糜標本會影不合格標本：嚴重黃疸、溶血、乳糜標本會影響測結(jié)果，需重新采血進行檢測。響測結(jié)果，需重新采血進行檢測。干擾因素v據(jù)報道可能產(chǎn)生假陽性的原因有： 1.應(yīng)用纖維素膜進行血液透析患者; 2.某些紗布或其他醫(yī)療物品中含有葡聚糖; 3.靜脈制劑（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白）等含有葡聚糖; 干擾因素 4.某些細菌敗血癥患者（尤其是鏈球菌敗血癥）; 5.抗腫瘤類藥物(香菇多糖、裂殖菌多糖); 6.磺胺類藥物; 7.蘑菇類食物; 臨床細菌內(nèi)毒素及(1-3)-D-葡聚糖檢測的