分子生物學(xué)常用技術(shù)原理

1、Genetic engineering重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉分子生物學(xué)常用技術(shù)原理 相關(guān)概念相關(guān)概念DNA克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因載體基因載體 基本原理基本原理 重組重組DNA技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容克隆

2、克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無，即無性繁殖。性繁殖。技術(shù)水平：分子克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌游锘蛑参铮﹤€(gè)體克隆（動物或植物）生物技術(shù)工程生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等酶工程、細(xì)胞工程等目的目的 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(

3、genetic engineering) 利用基因克隆方法獲取目的基因并使克隆的基因表達(dá)為蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物或定向改造細(xì)胞乃至生物個(gè)體的特征及相關(guān)的工作稱基因工程，、 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶多核甘酸激酶等多核甘酸激酶等重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷

4、酸二羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚聚合、合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第第二鏈合成，雙鏈二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行

5、填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基（一）限制性核酸內(nèi)切酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶1、概念、概念限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別是識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點(diǎn)或其周并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGC

6、CTAGGATCC GBam H第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶類酶識別序列特點(diǎn)類酶識別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口：平端切口、粘端切口粘端切口3、限制性核酸內(nèi)

7、切酶的識別和切割位點(diǎn)、限制性核酸內(nèi)切酶的識別和切割位點(diǎn)Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口5 G AATTC.33 CTTAA G.55G AATTC.33CTTAA G55CTGCA G 3 3 G ACGTC55CTGCA G33G ACGTC5作用作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身保護(hù)自身DNA。*分類分類、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）（二）、其它工具酶（二）、其它工具酶1、DN

8、A連接酶連接酶、三、載體三、載體定義定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或?yàn)閿y帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分分子。子。常用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA粘粒粘粒DNA克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體

9、稱為表達(dá)載體。三、載體三、載體此處是標(biāo)題wanghome表表 達(dá)達(dá) 載載 體體載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 能自主復(fù)制； 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源DNA。（一）、（一）、 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn)特點(diǎn): :能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克隆）克?。〦MBL

10、系列（置換型，適用基因組克隆系列（置換型，適用基因組克隆）. 噬菌體噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列（三）（三） 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid)其它：如其它：如酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)用動物病毒用動物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）重組重組DNA(r

11、ecombinant DNA) -分子克隆分子克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或 DNA克隆) 。 四、重組四、重組DNA技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基

12、因的表達(dá) 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程目目 錄錄（一）目的基因的制備（一）目的基因的制備1. 化學(xué)合成法化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。2.基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) * 化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列序列組織或細(xì)

13、胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合* 從基因組從基因組DNA文文庫獲取目的基因庫獲取目的基因限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外

14、包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫目目 錄錄mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制* 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T目目 錄錄（二）目的基因與載體的連接（二）目的基因與載體的連接1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)

15、同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)連接Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連

16、目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接目目 錄錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連限制酶切位點(diǎn)連接相似。接相似。

17、目目 錄錄 2. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3. 平端連接平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連目目 錄錄5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3

18、 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體目目 錄錄4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭及其應(yīng)

19、用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)（三）重組（三）重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌（四）重組體的篩選和鑒定（四）重組體的篩選和鑒定 1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇（遺傳學(xué)方法）抗藥性標(biāo)記選擇（遺傳學(xué)方法）(2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子

20、雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡 2. 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等 3. 基因重組與表達(dá)技術(shù) 基因來源基因來源: 酶切片段酶切片段 mRNA cDNA (RT-PCR) PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 化學(xué)合成：單鏈寡核苷酸化學(xué)合成：單鏈寡核苷酸互補(bǔ)寡核苷酸鏈退火時(shí)互補(bǔ)寡核苷酸鏈退火時(shí),注意溫度變化要非常的緩慢注意溫度變化要非常的緩慢,有利有利于寡核苷鏈完全正確互補(bǔ)成雙鏈于寡核苷鏈完全正確互補(bǔ)成雙鏈 (95 自然冷卻至室溫自然冷卻至室溫)克隆重組克隆重組克隆載體的選擇克隆載體的選擇 抗生素雙抗性載體：抗生素雙抗性載體： 互補(bǔ)篩選互補(bǔ)篩選: p

21、UC19 pBluecript II 基因與載體的連接基因與載體的連接 外源片段與載體的比例：平端外源片段與載體的比例：平端 (3-10):1，粘端，粘端 1:1轉(zhuǎn)化宿主轉(zhuǎn)化宿主:JM109 DH5 重組子的篩選與鑒定重組子的篩選與鑒定抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet重組子的篩選與鑒重組子的篩選與鑒定定AmN2H 宿主宿主菌菌重組子的篩選與鑒定藍(lán)白篩選重組子的篩選與鑒定藍(lán)白篩選原理原理原理原理藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選 互補(bǔ)：互補(bǔ)：laz編碼的編碼的肽鏈肽鏈；半乳糖苷酶突變體半乳糖苷酶突變體-互補(bǔ)（互補(bǔ)（-complementation）：）：在在T-vector或或 PUC質(zhì)粒序列中，插入

22、了質(zhì)粒序列中，插入了lac啟動子啟動子-操縱操縱子基因序列以及編碼子基因序列以及編碼-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N-端端145個(gè)氨基酸的個(gè)氨基酸的核苷酸序列（又稱核苷酸序列（又稱-肽）；肽）；這類載體對應(yīng)的宿主菌（如這類載體對應(yīng)的宿主菌（如JM、DH5系列）系列）-半乳半乳糖苷酶基因失去了編碼糖苷酶基因失去了編碼-肽堿基序列肽堿基序列只有當(dāng)這類載體引入到宿主菌后，載體上的只有當(dāng)這類載體引入到宿主菌后，載體上的-半乳糖半乳糖苷酶苷酶N-端片端才能與宿主菌的缺陷端片端才能與宿主菌的缺陷-半乳糖苷酶互補(bǔ)，半乳糖苷酶互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，這種作用稱為半乳糖苷酶，這種作用稱為-互補(bǔ)?；パa(bǔ)

23、。重組子鑒定挑分離良好，大小中等的菌挑分離良好，大小中等的菌落培養(yǎng)落培養(yǎng)5ml菌液菌液小量制備質(zhì)粒小量制備質(zhì)粒酶切，瓊脂糖凝膠電酶切，瓊脂糖凝膠電泳泳測序測序基因表達(dá) 選擇表達(dá)系統(tǒng) 原核系統(tǒng) 真核酵母 動物細(xì)胞 植物細(xì)胞 構(gòu)建表達(dá)載體 重組克隆載體 表達(dá)載體 目的基因亞克隆目的基因亞克隆 正確的正確的ORF 導(dǎo)入細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞: 化學(xué)方法（化學(xué)方法（CaCl2)、電轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化 、顯微注射、顯微注射、 基因槍基因槍 外源基因表達(dá)外源基因表達(dá): 化學(xué)誘導(dǎo)、溫度誘導(dǎo)化學(xué)誘導(dǎo)、溫度誘導(dǎo) 基因表達(dá)檢測基因表達(dá)檢測: SDS-PAGE 、RT-PCR、Western Blot亞克隆亞克隆一、定義一、定義

24、將克隆將克隆DNA片段從一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體片段從一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體二、應(yīng)用二、應(yīng)用 研究克隆研究克隆DNA片段其中的一段序列克隆片段其中的一段序列克隆 DNA片段的表達(dá)片段的表達(dá)( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇目目 錄錄組氨酸缺陷組氨酸缺陷型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成促進(jìn)組氨酸合成 DNADNA重組體重組體標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救 互補(bǔ)互補(bǔ)目目 錄錄 互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測測目目 錄錄原原位位雜雜交交目目 錄錄Southern印跡印跡目目 錄錄雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋

25、白的克隆和檢出目目 錄錄重組重組DNADNA技術(shù)操作過程可形象歸納為技術(shù)操作過程可形象歸納為 小小 結(jié)結(jié)分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選

26、表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交目目 錄錄表達(dá)體系的建立表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（五）克隆基因的表達(dá)（五）克隆基因的表達(dá)1. 原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）表達(dá)體系最為常用）標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動子強(qiáng)啟動子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)多接頭克隆位點(diǎn)E.coli表達(dá)體系的不足表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基因組不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性

27、包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白很難表達(dá)大量可溶性蛋白大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌的表達(dá)和分泌目目 錄錄優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2. 真核表達(dá)體系真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動

28、物細(xì)胞酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜目目 錄錄目目 錄錄 重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進(jìn)凝血促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細(xì)胞生長與分化刺激細(xì)胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些

29、腫瘤白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療向治療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預(yù)防乙肝預(yù)防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂預(yù)防霍亂基因診斷基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子生利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。或插入等突變。（

30、三）基因診斷（三）基因診斷基本過程基本過程區(qū)分或鑒定區(qū)分或鑒定DNA的異常的異常分離、擴(kuò)增待測的分離、擴(kuò)增待測的DNA片斷片斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn). 能正確擴(kuò)增靶基因；能正確擴(kuò)增靶基因；. 能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別；能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別；. 本底或噪聲低，不干擾本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定的鑒定;. 便于完全自動化操作，適合大面積、便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查大人群普查。（四）基因治療（四）基因治療定義定義基因治療基因治療(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償?shù)募?xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的

31、。其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。方式方式體細(xì)胞基因治療體細(xì)胞基因治療 (somatic cell gene therapy)性細(xì)胞基因治療性細(xì)胞基因治療 (germ line gene therapy)分子生物學(xué)常用技術(shù) 凝膠電泳() 分子雜交() 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)() DNA的物理圖譜 DNA序列測定 基因芯片第一節(jié) 凝膠電泳(gel electrophoresis) 電泳概念 基本原理 Q 6r : 遷移率 Q : 電荷量 r : 粒子半徑（分子量） : 介質(zhì)粘度 電泳的用途分離鑒定純度測定分子量 凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳() 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （一）分離核酸原理 電荷

32、效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 分子構(gòu)象瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis) 分離核酸原理 操作要點(diǎn) 應(yīng)用范圍1. 電荷效應(yīng) 核酸是兩性電解質(zhì) pH = 3.5 , 正電荷 pH = 8.08.3 , 負(fù)電荷，正極2.分子篩效應(yīng) 小分子移動快 ，大分子移動慢3. 分子構(gòu)象 閉環(huán)超螺旋線狀DNA開環(huán)DNA +-（二）操作要點(diǎn) 支持物 凝膠濃度的選擇 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 電泳緩沖液 樣品制備 電泳條件 DNA電泳染色 DNA片段的回收 1. 支持物商品化的瓊脂糖瓊脂糖種類普通低熔點(diǎn)高純高篩分熔點(diǎn)8090100ng 上樣緩沖液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚藍(lán)/二甲苯青 點(diǎn) 樣6

33、.電泳條件 潛水電泳 恒壓電泳 低壓: 12V/cm 中壓: 810V/cm 高壓：幾十V/cm 溫度：1525 潛水電泳7.電泳染色 溴乙錠(ethidium bromide, EB) 結(jié)構(gòu)及染色原理 染色方法加入凝膠液中 電泳結(jié)束后染色 EB染色原理紫外燈下顯色8. DNA片段的回收 低熔點(diǎn)瓊脂糖法 透析袋電洗脫法(5kb) DEAE-纖維素膜法(0.55kb)（三）應(yīng)用范圍 DNA的分離、純化和鑒定 限制性酶切圖譜分析 重組體的分離、鑒定 雜交分析 PCR產(chǎn)物的分離鑒定 第二節(jié) 分子雜交 分子雜交的基本原理 固相支持物 探針 幾種常用雜交技術(shù)一、分子雜交的基本原理 核酸的變性和復(fù)性n核酸

34、分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復(fù)性過程中，如果把不同復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理復(fù)性復(fù)性RNADNA雜交條件 靶分子-支持物 探針 雜交袋 雜交爐雜交種類 被檢核酸種類和方法 原位雜交斑點(diǎn)雜交

35、Southern雜交Northern雜交Western雜交 反應(yīng)介質(zhì) 液相雜交 固相雜交()二、固相支持物 硝酸纖維素濾膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龍膜(nylon membrane)1.硝酸纖維素濾膜 特點(diǎn)吸附ssDNA和RNA 本底低 不足不適于重復(fù)雜交濾膜較脆 不適于電轉(zhuǎn)移法 對DNA小片段(缺口翻譯 操作簡便 DNA/cDNA 探針 DNA的5末端標(biāo)記(5end labeling) 堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶 標(biāo)記原理 制備寡核苷酸探針 制備短的DNA/RNA探針 （一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子利用各種物理

36、方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。，譯為印跡技術(shù)。 用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù)二、印跡技

37、術(shù)的類別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern Blotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western Blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 3 3、應(yīng)用：、應(yīng)用：（1 1）檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異）檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異 mRNAmRNA的表達(dá)水平的表達(dá)水平（2 2）比較不同組織和細(xì)胞

38、中的同一基因的）比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的 表達(dá)情況表達(dá)情況（三）蛋白質(zhì)印跡（三）蛋白質(zhì)印跡 (Western Blot) (Western Blot) 1 1、概念：、概念： 蛋白質(zhì)在電泳之后可以被從膠中轉(zhuǎn)移和固定到蛋白質(zhì)在電泳之后可以被從膠中轉(zhuǎn)移和固定到模型材料上，再與溶液中相應(yīng)的蛋白分子相互結(jié)模型材料上，再與溶液中相應(yīng)的蛋白分子相互結(jié)合，其中最常用的是用抗體檢測，因此被稱為免合，其中最常用的是用抗體檢測，因此被稱為免疫印跡。相對于疫印跡。相對于DNADNA的的Southern BlotSouthern Blot和和RNARNA的的Southern BlotSouthern Blot

39、，蛋白質(zhì)印跡被稱為，蛋白質(zhì)印跡被稱為Western BlotWestern Blot。2 2、基本過程：、基本過程： (1) (1) 電泳（電泳（ElectrophoresisElectrophoresis）：）： 一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用條件總要確一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。互間的聚集。 最常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑最常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDSSDS與某一與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣還原劑并用，并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。于電泳凝膠上

40、。 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體。體。 目前進(jìn)行的目前進(jìn)行的WesternWestern印跡反應(yīng)大多還是從凝膠上印跡反應(yīng)大多還是從凝膠上直接把蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜之上。蛋直接把蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜之上。蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移方可實(shí)現(xiàn)。白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移方可實(shí)現(xiàn)。 (2) (2) 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜(Transfer)(Transfer)：(3)(3)封閉封閉(Blocking)(Blocking)： 封閉可能結(jié)合非相關(guān)蛋白的位點(diǎn)以降低這類非封閉可能結(jié)合非相關(guān)蛋白的位點(diǎn)以降低這類非特異性結(jié)合背景的效果。特異性結(jié)合背景的效果。

41、現(xiàn)已設(shè)計(jì)的封閉液有多種，其中脫脂奶粉最為現(xiàn)已設(shè)計(jì)的封閉液有多種，其中脫脂奶粉最為價(jià)廉物美，既使用方便又可與通常使用的所有免價(jià)廉物美，既使用方便又可與通常使用的所有免疫學(xué)檢測系統(tǒng)兼容。只有一種情況，也就是當(dāng)牛疫學(xué)檢測系統(tǒng)兼容。只有一種情況，也就是當(dāng)牛奶中可能含有要用奶中可能含有要用WestemWestem印跡法檢測的蛋白質(zhì)印跡法檢測的蛋白質(zhì)時(shí)，不能使用脫脂奶粉作為封閉劑。時(shí)，不能使用脫脂奶粉作為封閉劑。(4)(4)一抗孵育一抗孵育(Primary antibody incubation)(Primary antibody incubation)： 特異性抗體（一抗）和轉(zhuǎn)移膜上相應(yīng)的蛋白分特異性抗

42、體（一抗）和轉(zhuǎn)移膜上相應(yīng)的蛋白分子結(jié)合子結(jié)合. .(5)(5)二抗孵育二抗孵育(Secondary antibody incubation)(Secondary antibody incubation)： 堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶(HRP)(HRP)或放射性核或放射性核素標(biāo)記的二抗與之反應(yīng)。素標(biāo)記的二抗與之反應(yīng)。 二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇。擇。 (6)(6)顯色：顯色：用放射自顯影或底物顯色檢測蛋白質(zhì)區(qū)帶的用放射自顯影或底物顯色檢測蛋白質(zhì)區(qū)帶的信號，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高信號，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高敏感度敏感度. .放放射射自自顯顯

43、影影照照片片n其他：其他：斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn)放放射射自自顯顯影影照照片片DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣n核酸序列分析的基本原理：核酸序列分析的基本原理： 化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 (Maxam-Gillbert法法) DNA鏈的末端合成終止法鏈的末端合成終止法 (Sanger法法)第三節(jié)第三節(jié)核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis一、

44、一、DNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法GATC 測序反應(yīng)測序反應(yīng) 電泳電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正極正極負(fù)極負(fù)極ddGddAddTddCn鏈末端合成終止法測定鏈末端合成終止法測定DNA序列的原理序列的原理二、二、DNA自動測序自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛

45、細(xì)管電泳）分離后，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。堿基的排列順序。 ddGddAddTddC紅色紅色熒光熒光綠色綠色熒光熒光黃色黃色熒光熒光藍(lán)色藍(lán)色熒光熒光電泳電泳DNA序列自動分析原理及結(jié)果圖序列自動分析原理及結(jié)果圖四、Southern 雜交 Southern blotting/DNA blotting 1975年，Edwen Southern等 印跡(blot

46、ting) : 轉(zhuǎn)移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 1. 印跡的方法 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 電轉(zhuǎn)移法 真空轉(zhuǎn)移法 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 電轉(zhuǎn)移法2. Southern 雜交的步驟五、Northern 雜交 RNA blotting 步驟 總RNA/mRNA變性電泳分離轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影/化學(xué)顯色 應(yīng)用檢測組織/細(xì)胞中mRNA的大小、量 比較不同組織/細(xì)胞中基因的表達(dá)情況 Northern 雜交六、Western 雜交 免疫印跡(immunoblotting) SDS-PAGE轉(zhuǎn)移蛋白第一抗體標(biāo)記的第二抗體(探針)檢測 應(yīng)用-蛋白質(zhì)的定性定量分析免疫印跡

47、Southern,Northern & Western待測物質(zhì) 支持物 探針 轉(zhuǎn)移方式Southern DNANC 單鏈核酸 毛細(xì)管/電/真空 Northern RNANC/尼龍 單鏈核酸 毛細(xì)管/電/真空 Western 蛋白質(zhì)NC/PVDF 抗體電轉(zhuǎn)移 第二節(jié)第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技術(shù)的技術(shù)的工作原理工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

48、5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR體系基本組成成分體系基本組成成分n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第三節(jié) PCR技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction, PCR) PCR的基本原理和步驟 PCR的影響因素一、PCR的基本原理和步驟 基本原理DNA復(fù)制 三個(gè)步驟變性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(ex

49、tension) 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 10X 擴(kuò)增緩沖液： 10ul 模板DNA: 0.12ug 引物： 各0.21umol/L 4種dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 總體積： 100ul二、PCR的影響因素 模板 pg-ug 引物 0.1-0.5uM Taq DNA聚合酶 1-5U 4種dNTP 20-200uM Mg2+ 1.5-2.5mM 過高: 非特異擴(kuò)增 過低 : 反應(yīng)產(chǎn)物減少 循環(huán)條件 25-35 引物長度：1530nt G+C含量：4060% 堿基的隨機(jī)分布 避免引物自身和引物之間的互補(bǔ) 引物的3端 引物的5端

50、引物濃度：0.21umol/L 自動搜索：Primer Premier 5.0 在線設(shè)計(jì)：/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi 分析評價(jià)：Oligo 6.0循環(huán)條件 變性溫度和時(shí)間: 9096, 3060s 退火溫度和時(shí)間: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸溫度和時(shí)間7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min 循環(huán)次數(shù): 2535 次 聚合酶鏈聚合酶鏈?zhǔn)绞椒磻?yīng)反應(yīng)1. Denaturation2. Annealing3. ExtensionPCR.

51、EXE5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。Essential ComponentsEssential Components of of PCR ReactionPCR Reaction salts (ions)利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為模板獲為模板獲得已知目的基因片段得已知

52、目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段；利用簡并引物從利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆文庫或基因組文庫中克隆基因。基因。 二、二、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆利用利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。變等改造。 PC

53、R技術(shù)高度敏感，對模板技術(shù)高度敏感，對模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突變（二）基因突變將將PCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNA序列測定，使測序序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測待測DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。進(jìn)行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性因突變檢測的敏感性 。（四）（四）DNA序列測定

54、序列測定（五）基因突變分析（五）基因突變分析 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是是將將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù) 原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單

55、個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測雜交，即可檢出待測DNA或或RNA是否在該組織或細(xì)胞中是否在該組織或細(xì)胞中存在。存在。 原位原位PCR方法彌補(bǔ)了方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù)熒光定量PCR技術(shù) 原理原理 熒光探針：熒光探針：(1) Molecular Beacon (2)TaqMan Molecular BeaconQ淬淬滅滅R 發(fā)光發(fā)光 特異性熒特異性

56、熒光雙標(biāo)記光雙標(biāo)記探針探針 Taq酶酶 5353外切酶活外切酶活性性(2) TaqManRQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標(biāo)記探針（雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）定量定量: : 通過外標(biāo)準(zhǔn)來定量未知樣品通過外標(biāo)準(zhǔn)來定量未知樣品 標(biāo)準(zhǔn)品制備 1、 標(biāo)準(zhǔn)菌標(biāo)準(zhǔn)菌 2 、構(gòu)建質(zhì)粒、構(gòu)建質(zhì)粒 3 、化學(xué)合成基因片段、化學(xué)合成基因片段 標(biāo)準(zhǔn)品的定量標(biāo)準(zhǔn)品的定量 1、 標(biāo)準(zhǔn)菌：拷貝數(shù)已知標(biāo)準(zhǔn)菌：拷貝數(shù)已知（衛(wèi)生部）（衛(wèi)生部） 2 、無限梯度稀釋無限梯度稀釋： 高濃度按高濃度按10倍濃度梯度逐漸稀釋倍濃度梯度逐漸稀釋10n 10n-1 101 0 熒光定量P

57、CR設(shè)計(jì)流程靶基的選擇靶基的選擇設(shè)計(jì)引物與探針設(shè)計(jì)引物與探針制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 預(yù)實(shí)驗(yàn)：特異性敏感性預(yù)實(shí)驗(yàn)：特異性敏感性（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動態(tài)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。 n實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理技術(shù)原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物RQ 3355基因克隆技術(shù) c差示分析法大規(guī)模克隆技術(shù)gene map-based cloningRACE(rapid amp

58、lification of cDNA)技術(shù) 可以擴(kuò)增缺失的DNA序列。 可以完成3和5的未知序列的擴(kuò)增。5擴(kuò)增3擴(kuò)增文庫的構(gòu)建與篩選 文庫 c文庫 篩選方法 基因組基因組DNA文庫文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫文庫(cDNA library) n基因文庫基因文庫( (gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫是指生物的文庫是指生物的基因組基因組DNA的的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼

59、區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫的載體有用于構(gòu)建基因組文庫的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。n基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選n基因組文庫篩選結(jié)果舉例基因組文庫篩選結(jié)果舉例cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)

60、信息。式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNA文庫文庫第五節(jié)第五節(jié)生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密排片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作