(完整word版)SephadexLH-20使用說明

1、技術文章Sephadex LH-20 使用說明Sephadex LH-20使用說明1 Sephadex G型葡聚糖凝膠只適合在水中使用，SephadexG-25羥丙化后就是SephadexLH-20。其既有分子篩作用， 在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高，但由于性能頗佳，可再生利用，所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少，對處理小樣品較好，這也是實驗室常用的原因之一。2Sephadex LH20 SephadexLH20的原理。的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子

2、的化合物保留強， 最后出柱。 如果使用反相溶劑洗脫， SephadexLH20 對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。3Sephadex LH20洗脫溶劑。SephadexLH20洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100 甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿甲醇最為常見，先用50 氯仿甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用 100 甲醇沖柱。4Sephadex LH20樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性大，這選用反相溶

3、劑洗脫（甲醇水），樣品用最少體積的甲醇水（盡可能甲醇少一些） 溶解，過濾后， 濕法上樣（一定要濾！ 要是把 Sephadex LH20 堵啦，就得將 SephadexLH20 的柱頭部分棄去） 。如果樣品極性小， 這選用正相溶劑洗脫 （氯仿甲醇），樣品用最少體積的氯仿甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。5Sephadex LH-20的步驟。(1) 選擇條件：梯度洗脫在Sephadex 使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng) ;極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。(2) 飽和層析柱：用洗脫劑

4、將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關，流出幾個柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。(3) 樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。(5) 洗脫：控制流速，一般 1drop/s 以下，可參見廠家的一些參數(shù) ;必要時更改極性（很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢）。再生以備下次使用。6 分離的技巧（1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。（ 2）柱子盡可能長， SephadexLH20 柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。（

5、3） 餾分一定要接的細，可 1 10 ，或 1 20 個保留體積接成一餾分。（ 4） 洗脫體積一般為 2-3 個保留體積， 對特殊保留強的化合物， 可洗脫 5 個保留體積。（ 5）鞣質成分死吸附嚴重，不建議用LH20 分鞣質。（ 6） SephadexLH20 對黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻參考。（ 7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。Sephadex LH-20 是由葡聚糖 G-25 羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產物在有機溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等， Phar

6、madex LH-20 同時適用于分子類別非常相似的物質的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于最終精制步驟，如非對映同分異構體的分離。制備凝膠懸浮液裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄），越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對于Sephadex LH-20而言， 25 100 m 的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。然而當膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱（最高至 250cm ）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲槽都必須進行徹底的清洗。Sephadex LH-20 在使用之前必須進行溶

7、脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分攪拌，否則會破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。1 在室溫下， 將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請參考后頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。2 使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的 75% ，上層溶劑占 25% ，這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠?？梢苿印? 將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內，在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba 。平衡上樣前， 用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變溶劑應該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質，并根據(jù)性質確定柱高調節(jié)

8、器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。洗脫液為確保延長層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應該離心或經過 0.45um 的膜過濾以除去雜質。樣品樣品體積應該占柱總體積的1-2% ，同樣在使用之前樣品應該離心或經過0.45um 的膜過濾。洗脫洗脫流速應根據(jù)情況而定，最大張性流速約12cm/min （反壓 1.5ba ），建議流速為1-10cm/h ?？傮w來說，較低的流速，具有較高的分辯率。再生凝膠再生通常是先用2-3 個柱體積的洗脫液進行清洗，如更換洗脫液， 則需要重新平衡。體積流速與線性流速的關系線性流速 =體積流速 /橫截面積溶脹體積由于 Pharmadex LH-20 的溶

9、脹體積依賴于溶劑， 所以對于不同直徑的柱可根據(jù)比例增加或減少舊柱體積以便計算出新體積。新體積 = 舊體積 ×（新柱體積 /舊柱體積）膠的性質Sephadex LH-20 同時具備親水和親脂雙重性質， 且被分離物質的極性在分離過程中起著重要作用。排阻極限4-5KD （與所用溶劑有關）上樣量吸附模式取決于所需分辯率分子量大小小于總體積的20%正相分配小于總體積的1%其他膠粒形狀 球形，多孔顆粒大?。ǜ桑?8-111um（直徑）顆粒大小中間值（干）70um （直徑）顆粒大小（甲醇） 27-163um （直徑）顆粒大小中間值（甲醇）103 um （直徑）最大線性流速720cm/min參考線性

10、流速60 cm/minpH 的穩(wěn)定性操作中 2-11清洗中 2-13化學穩(wěn)定性 在許多水溶液及有機溶劑系統(tǒng)中都穩(wěn)定。在 pH2 以下或強氧化劑中不穩(wěn)定高壓滅菌 121 可忍受 20分種操作溫度 4到 40 保存條件新填料4-25 （干燥）使用后填料4-8 ， pH6-8 切勿冷凍，加入抑菌劑（如20% 乙醇 0.04% 疊氮鈉）干膠溶脹表溶劑床體積（ ml 凝膠 /g 干膠粉末）Dimethylsulphoxide二甲亞砜4.4 4.6Pyridine嘧啶4.2 4.4Water 水4.0 4.4Dimethylformamide二甲基甲酰胺3.8 4.2Saline 生理鹽水3.9 4.1M

11、ethanol甲醇3.8 4.1Methanedichloride二氯乙烷3.8 4.1Chloroform* 氯仿3.8 4.1Propanol丙醇3.7 4.0Ethanol*乙醇3.6 3.9Isobutanol 異丁醇3.6 3.9Formamide 甲酰胺3.6 3.9Methylenedichloride二氯甲烷3.6 3.9Butanol 丁醇3.5 3.8Isopropanol 異丙醇3.3 3.6Tetrahydrofuran 四氫呋喃3.3 3.6Dioxane二氧雜環(huán)已烷3.2 3.5Acetone丙酮2.4 2.6Acetonitrile* 乙腈2.2 2.4Carbo

12、ntetrachloride四氯化碳1.8 2.2Benzene 苯1.6 2.0Ethylacetate 乙酸乙酯1.6 1.8Toluene甲苯1.5 1.6* 包含 1%的乙醇* 包含 1%的苯* 溶脹膠體積小于 2.5ml/g 的溶劑沒有使用價值如果 Sephadex LH20 柱子被弄臟了，大多數(shù)情況下是由于樣品沒濾，將柱頭堵住，或由于樣品的死吸附（一般很少發(fā)生），使柱子的柱頭部分污染，一般的處理是將被污染的柱頭部分的填料棄去， 具體做法很簡單， 只將被污染的柱頭部分的填料用玻棒輕輕攪起，倒掉即可。如果柱子整個被污染，如果是將 Sephadex LH20 用反相被污染，辦法如下：依次用水， NaOH-NaCl 水溶液，水，甲醇洗滌被污染的柱子。因為是整個柱子被污染