食品微生物檢驗方法課件VIP

1、食品微生物檢驗方法食品微生物檢驗方法l菌落總數(shù)檢測l大腸菌群及大腸桿菌檢測l金黃色葡萄球菌檢測l沙門氏菌檢測l單核細胞增生李斯特氏菌檢測食品微生物檢驗方法l菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。食品微生物檢驗方法l判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質量。l及時反映食品加工過程是否符合 衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學評 價提供依據(jù)。l通常認為，食品中細菌數(shù)量越多， 則可考慮致病菌污染的可能性越 大，菌落總數(shù)的多少在一定程度 上標志著食品衛(wèi)生質量的優(yōu)劣。 食品微生物檢驗方法 檢樣xg/mL+9xml稀釋液（

2、磷酸鹽緩沖液） 適當十倍稀釋樣品選擇23個連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內（每個稀釋度做兩個平行） 每皿內加入適量平板計數(shù)瓊脂（PCA） 35 ，48 2h菌落計數(shù) 食品微生物檢驗方法l選擇25250CFU之間的菌落進行計數(shù)，計算公式如下： N=C/（1*n1+0.1*n2）*dl所有平板的菌落數(shù)都不足25CFU，報告EAPC/ml（g）為25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate countl所有平板的菌落數(shù)都超過250CFU，但不足100/cm2 ，報告EAPC/ml（g）為最接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計值，乘以相應的稀釋度。l所有平板的菌落數(shù)

3、都超過100/cm2 ，計算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計最高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應平板面積作為該稀釋度的菌落計數(shù)結果，報告EAPC/ml（g）為65*100* 1/d。l無法計數(shù)的平板報告LA（Laboratory Accident）。l最終結果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進偶不進。食品微生物檢驗方法 檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液） 適當十倍稀釋樣品選擇23個連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內（每個稀釋度做兩個平行） 每皿內加入適量（1215mL）平板計數(shù)瓊脂（PCA）， 301 ，72 3 h菌落計數(shù) 如果懷疑樣品中含

4、有如果懷疑樣品中含有在培養(yǎng)基表面蔓延生在培養(yǎng)基表面蔓延生長的菌落，待瓊脂凝長的菌落，待瓊脂凝固后，在其上覆蓋一固后，在其上覆蓋一層（層（4mL4mL）水瓊脂。）水瓊脂。平板疊放不超過6個食品微生物檢驗方法l選擇連續(xù)2個稀釋度不超過300CFU的平板，且一個平板至少含15CFU進行計數(shù)，計算公式如下： N=C/（n1+0.1*n2）*dl所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計算2平板菌落的算術平均值m，液體樣品：NE=m 固體樣品： NE=md-1l無菌生長：液體樣品：less than 1; 固體樣品：less than 1 d-1l最終結果保留前兩位有效數(shù)字。食品微生物檢驗方法l由于檢樣中采用

5、30/35有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實際的總活菌數(shù)，一些特殊營養(yǎng)要求的細菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細菌，均難以反映出來。l鑒于食品檢樣中的細菌細胞是以單個、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細胞塊，也可以來源于單個細胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應報告活菌數(shù)，而應以單位重量、容積或表面積內的菌落數(shù)或菌落形成單位（colony forming units，CFU）報告。食品微生物檢驗方法l每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過15min，主要為防止細菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內瓊脂

6、凝固后，不要長時間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長。l檢樣過程中應用稀釋劑做空白對照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時，檢樣過程中應在工作臺上打開一塊空白平板計數(shù)瓊脂，其暴露時間應與檢樣時間相當，以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空氣的污染。l檢樣稀釋液有時帶有食品顆粒，為避免與細菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4 放置，以便在計數(shù)檢樣時用作對照。食品微生物檢驗方法l大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。l大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學方面的要求，提出的與糞便污染有關的細

7、菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據(jù)進一步的生化試驗，可將這群細菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。 食品微生物檢驗方法l大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。l大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗（靛基質、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為+-或-+-的細菌。l與人類有關的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿

8、菌（EAEC）。食品微生物檢驗方法食品微生物檢驗方法l大腸菌群和大腸桿菌是評價衛(wèi)生質量的重要指標，作為食品中的糞便污染指標。l食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。l大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標。食品微生物檢驗方法基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短

9、小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。食品微生物檢驗方法培養(yǎng)特性：l大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44 條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 。l 在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理

10、鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。食品微生物檢驗方法 檢樣50g+450ml稀釋液 適當十倍稀釋樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導管），每管接種1mL 35 ，24 2h 48 2h 沒有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培養(yǎng)） 24 2h 48 2h 查MPN表報告結果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35、1824h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個可疑菌轉接到PCA斜 面，進行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復檢產(chǎn)氣 查MPN表報告結果

11、（大腸桿菌） 食品微生物檢驗方法lMPNMPN檢索表：檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數(shù)字應相應降低或增加10倍。l初發(fā)酵和證實試驗：初發(fā)酵和證實試驗： 1）兩步法進行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸

12、菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來促進菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。 2）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。l產(chǎn)氣量與倒管：產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內極微少的氣泡（有時比小米粒還小），有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使

13、發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應作進一步試驗。 食品微生物檢驗方法EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤食品微生物檢驗方法lEMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長；l高壓滅菌可使得美藍還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動培養(yǎng)基可以恢復原有的正常紫色，傾注平板前應先搖勻；l大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；l該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培養(yǎng)細菌時都應在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸

14、埃希氏菌 紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無色鼠傷寒沙門氏菌 無色糞鏈球菌無色食品微生物檢驗方法基本原理： 革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。 革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構的不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少。當用酒精或丙酮酸脫色時，類脂質被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細胞被脫色，經(jīng)復染后，又染上復染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量

15、多而且交聯(lián)度大，類脂質含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞仍保留初染時的顏色。食品微生物檢驗方法Gram negativeGram positiveGram straining食品微生物檢驗方法基本步驟：l將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染1min，水洗；l滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；l滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；l滴加番紅復染液，復染1min，水洗、待干、鏡檢。l結果：革蘭氏陽性菌呈，革蘭氏陰性菌呈。食品微生物檢驗方法Testpositivenegativebiotype1 biotype2reagentI

16、ndole紅色環(huán)不變色+-KovacsMR紅色不變色+甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色-V-P甲、乙液Citrate生長不生長-食品微生物檢驗方法I M Vi C生化試驗生化試驗食品微生物檢驗方法l根據(jù)根據(jù)伯杰氏鑒定細菌學手冊伯杰氏鑒定細菌學手冊，按葡萄，按葡萄球菌的生理化學組成，將葡萄球菌分為金球菌的生理化學組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌黃色葡萄球菌( (Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus) )、表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌( (S. epidermidisS. epidermidis) )和腐生葡和腐生葡萄球菌萄球菌( (S. saprophy

17、ticusS. saprophyticus) )，其中金葡多，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。為致病性菌，表葡偶爾致病。l金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中最常金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中最常見的病原菌?？梢鹁植炕撔愿腥?，如見的病原菌?？梢鹁植炕撔愿腥荆绨X、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面癤、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生葡萄球

18、菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。的毒素和侵襲性酶。 食品微生物檢驗方法金黃色葡萄球菌呈球形，直金黃色葡萄球菌呈球形，直徑徑0.8m0.8m左右，排列成葡萄左右，排列成葡萄串狀串狀 ，無芽孢，無莢膜。，無芽孢，無莢膜。革蘭氏染色陽性，但衰老、革蘭氏染色陽性，但衰老、死亡或被白細胞吞噬的菌體，死亡或被白細胞吞噬的菌體，常呈革蘭氏陰性。常呈革蘭氏陰性。食品微生物檢驗方法l金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內有時金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內有時液體澄清，菌量多時呈渾濁生長。液體澄清，菌量多時呈渾濁生長。l血平板上金黃色葡萄球菌呈金血平板上金黃色葡

19、萄球菌呈金黃色，有時也為白色，大而突黃色，有時也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。周圍有溶血圈。lBaird-ParkerBaird-Parker平板上金黃色葡萄平板上金黃色葡萄球菌圓形突起、光滑、濕潤，顏球菌圓形突起、光滑、濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度。油樹膠的硬度。食品微生物檢驗方法lMPNMPN法：適用于檢測帶有大量競爭菌的法：適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少

20、量金食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。黃色葡萄球菌的食品。l直接平板計數(shù)法：適用于檢查金黃色直接平板計數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于葡萄球菌數(shù)不小于10/g10/g（mlml）的食品。）的食品。l增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。的金黃色葡萄球菌的加工食品。定量方法定量方法定性方法定性方法食品微生物檢驗方法 檢樣（50g+450mL稀釋液） 適當十倍稀釋樣品 選擇23個連續(xù)適宜稀釋度 吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于 3塊90mmBaird-Parker平板上（做平行試驗） 35

21、，4548 h 確證試驗 報告或涂布于1塊140mm平板上食品微生物檢驗方法 檢樣（50g+450mL稀釋液） 適當十倍稀釋樣品 選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管10% NaCl TSB肉湯肉湯，每管接種1mL 35 ，48 2 h 從生長的管中接種1環(huán)劃線于 Baird-Parker平板上 35 ，48 h 確證試驗 報告含1%丙酮酸鈉食品微生物檢驗方法1.凝固酶試驗凝固酶試驗l方法：方法：從平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到TSB/BHI肉湯中，置35培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗兔血漿充分混合，置35培養(yǎng)，定時觀察是否

22、有凝塊形成，至少觀察6h。 試驗中需同時做已知陽性和陰性對照。試驗中需同時做已知陽性和陰性對照。l結果判定：結果判定：以內容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時不流動為陽性。部分凝固（2+和3+）的必須進行生化鑒定加以證實。食品微生物檢驗方法2.革蘭氏染色革蘭氏染色l對所有的可疑培養(yǎng)物都要進行革蘭氏染色。對所有的可疑培養(yǎng)物都要進行革蘭氏染色。3.3.生化鑒定生化鑒定l過氧化氫酶試驗過氧化氫酶試驗l葡萄糖厭氧利用試驗葡萄糖厭氧利用試驗l甘露醇厭氧利用試驗甘露醇厭氧利用試驗l金葡溶菌酶敏感性試驗金葡溶菌酶敏感性試驗l耐熱核酸酶試驗（輔助）耐熱核酸酶試驗（輔助）Staphylococcus aureus

23、on DNase Agar食品微生物檢驗方法特性S. aureusS.epidermidisMicrococci過氧化氫酶+凝固酶+-耐熱核酸酶+-溶菌酶+-厭氧利用葡萄糖+-甘露醇+-食品微生物檢驗方法 檢樣（xg+9xmL稀釋液） 適當十倍稀釋樣品 選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管modified Giolitti and Cantoni broth， 37 ，2448 h 從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中 接種1環(huán)培養(yǎng)物于 Baird-Parker平板上 37 ，48 h 確證試驗 報告接種接種10mL 10mL 于于10mL10mL雙料肉湯，雙料肉湯，接種接種1mL

24、1mL 于于9mL9mL單料肉湯。單料肉湯。小心的于接小心的于接種管中培養(yǎng)種管中培養(yǎng)基頂部傾注基頂部傾注一定量的水一定量的水瓊脂，使其瓊脂，使其凝固形成密凝固形成密封塞。封塞。食品微生物檢驗方法凝固酶試驗凝固酶試驗l結果判定：結果判定： - 1+ 2+ 3+ 4+ negative positive食品微生物檢驗方法l1880年E. Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬霍亂沙門氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。l沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學相關的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結構復雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多個血

25、清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型近200個。 食品微生物檢驗方法形態(tài)特征： 革蘭氏陰性，大小為130.40.9m的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運動力強。食品微生物檢驗方法培養(yǎng)特性：l沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10-42 都可生長，最適生長溫度為37，最適pH為6.87.8。l營養(yǎng)瓊脂平板上：3537培養(yǎng)1824h，其菌落大小一般為23mm，光滑、濕潤、無色、半透明、邊緣整齊。l血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：l絕大多數(shù)沙門氏菌有規(guī)律的發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但也有不產(chǎn)氣者，不發(fā)酵蔗糖和側金盞花醇、不產(chǎn)生吲哚、不分解尿素。食品微生物檢驗方法l菌體抗

26、原（O抗原）l表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原l鞭毛抗原（H抗原）l纖毛抗原食品微生物檢驗方法前增菌 25g樣+225mL乳糖肉湯 （肉制品、肉副產(chǎn)品、動物產(chǎn)品） 勻質2min，室溫放置60 5min 混合均勻，測定調節(jié)PH6.8 0.2 35、24 2h選擇性增菌 0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB 42、24h （水浴培養(yǎng)） 35、24h 43、24h（水浴培養(yǎng)） 含菌量高 含菌量低分離培養(yǎng) 劃線接種 選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、HE） 35、2448h（BS）生化鑒定 每個平板挑取至少2個可疑菌（包括典型和非典型各2個） 接種TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面

27、（LIA高層深4cm） （松蓋以保持有氧條件防止產(chǎn)生過多H2S） 35、242h 棄去 尿素酶試驗 衛(wèi)矛醇、 氰化鉀、丙二酸鈉、吲哚試驗 陽性 陰性血清學 血清學試驗沙門氏菌的分類 報告結果生鮮食物、嚴重污染的食品和動物飼料食品微生物檢驗方法前增菌 25g樣+225mLBPW 勻質 371、18 2h選擇性增菌 0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn 41.5 1、24 3h 37 1、24 3h （水浴培養(yǎng)）分離培養(yǎng) 劃線接種選擇性培養(yǎng)基（XLD和第二種選擇性培養(yǎng)基，如 BS） 37、2448h（BS） 每個平板挑取至少5個可疑菌進行純培養(yǎng)和確認試驗 37、243h 生化鑒定

28、 TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、-牛乳糖、V-P、 吲哚試驗血清學 血清學試驗沙門氏菌的分類 報告結果食品微生物檢驗方法試驗沙門氏菌屬傷寒A型副傷寒B型副傷寒C型副傷寒其他菌屬反應%b反應%b反應%c反應%c反應%bTSI葡萄糖產(chǎn)酸+100+100+100TSI葡萄糖產(chǎn)氣-d0+100+92TSI乳糖產(chǎn)酸-2-100-1TSI蔗糖產(chǎn)酸-0-0-1TSI硫化氫產(chǎn)生+97-10+92尿素水解賴氨酸脫羧酶+98-0+95-牛乳糖反應-0-0-2eV-P反應-0-0-0吲哚反應-0-0-1b：百分率表明并不是所有分離到的沙門氏菌血清型都會顯示+或-的結果。c：這些百分率不能從現(xiàn)有的文獻中獲得。d：傷寒

29、沙門氏菌不產(chǎn)氣e：亞利桑那亞型腸炎沙門氏菌為乳糖陽性或陰性反應，但通常-牛乳糖反應陽性。食品微生物檢驗方法XLD瓊脂：FDA BAM典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈 現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落。 非典型菌落：黃色帶或不帶黑色中心。ISO中心黑色、周圍由于指示劑顏色的改變而出現(xiàn)紅色的輕微透明帶。菌名菌落形態(tài)鼠傷寒沙門氏菌 紅色，有黑心傷寒沙門氏菌紅色，有黑心弗氏志賀氏菌紅色大腸埃希氏菌 黃色，有膽鹽沉淀環(huán)糞鏈球菌 -食品微生物檢驗方法BS瓊脂：FDA BAM典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周 圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培

30、養(yǎng)時間的延長而 變?yōu)楹谏?，并有暈環(huán)效應； 非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，周圍培養(yǎng) 基不變色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌 黑色，有金屬光澤鼠傷寒沙門氏菌 黑色，有金屬光澤奇異變形桿菌褐色或呈黑色，無金屬光澤弗氏志賀氏菌棕色至綠色大腸埃希氏菌 棕色至綠色糞鏈球菌 -50071 44104Blank 50115食品微生物檢驗方法HE瓊脂：FDA BAM典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶黑色 中心或幾乎全黑色。 非典型菌落：乳糖陽性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌 藍綠色，部分有黑心鼠傷寒沙門氏菌 藍綠色，部分有黑心奇異變形桿菌藍綠色，有或無

31、黑心弗氏志賀氏菌藍綠色大腸埃希氏菌 橙紅色，有膽酸鹽沉淀糞鏈球菌 -食品微生物檢驗方法TSI：典型反應：斜面產(chǎn)堿（K）：紅色； 底部產(chǎn)酸（A）：黃色； 產(chǎn)H2S：黑色（少數(shù)不產(chǎn)）菌名生化反應腸炎沙門氏菌 K/A，產(chǎn)氣，產(chǎn)H2S大腸埃希氏菌A/A，產(chǎn)氣銅綠假單胞菌 K/K奇異變形桿菌K/A，產(chǎn)H2S弗氏檸檬酸桿菌A/A，產(chǎn)H2S弗氏志賀氏菌K/A食品微生物檢驗方法l冷凍樣品解凍需在冷凍樣品解凍需在4545以下，有自動調溫器自控的水浴鍋內不斷以下，有自動調溫器自控的水浴鍋內不斷攪拌進行攪拌進行15min15min或在或在2-82-8，1818小時內軟化。小時內軟化。 為保證檢驗的準確性，必須在選擇

32、性培養(yǎng)基上挑取足為保證檢驗的準確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進行生化和血清學鑒定。夠數(shù)量的菌落進行生化和血清學鑒定。l進行生化反應時，應以純培養(yǎng)物進行試驗，如出現(xiàn)血清學陽性，進行生化反應時，應以純培養(yǎng)物進行試驗，如出現(xiàn)血清學陽性，而生化反應特征不符合時，應對接種物進行純化，用純化后的培而生化反應特征不符合時，應對接種物進行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進行生化試驗。養(yǎng)物重新進行生化試驗。 測試中應同時接種陽性對照菌株。測試中應同時接種陽性對照菌株。食品微生物檢驗方法l伯杰氏鑒定細菌學手冊第9版中，李斯特菌屬有7個種：單核細胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英諾克李

33、斯特氏菌（L. innocua） 、西爾李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威爾斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、綿羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。l單核細胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動物的感染，也可引起人的感染。食品微生物檢驗方法形態(tài)特征： 革蘭氏陽性短桿菌，大小為0.40.50.52m， 兩端鈍圓，常兩兩相串成彎曲及V形，偶爾有球狀、雙球狀、短鏈狀，但很少有長鏈狀，兼性厭氧、無芽孢，一般不形成莢膜。該菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脫落。20培養(yǎng)后可見到很多鞭毛。食品

34、微生物檢驗方法培養(yǎng)特性：l生長溫度為242（冷藏不能阻止該菌的生長），最適生長溫度為3537。2025 培養(yǎng)有動力，37 培養(yǎng)動力消失；在顯微鏡下觀察該菌新鮮的室溫肉湯培養(yǎng)物可見翻筋斗運動。l在pH3.84.4仍能生長，在pH中性至弱堿性（9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好， 在6.5%NaCl肉湯中也能良好生長。l血平板上：菌落通常不大呈灰白色， 刺種血平板可產(chǎn)生窄小的溶血環(huán)。食品微生物檢驗方法 檢樣25g增菌 EB增菌液基礎225mL 30 4h 加入抑菌劑 30 20h 30 44h 選擇性分離培養(yǎng) 接種OXA和 PALCAM 接種OXA和 PALCAM 35 2

35、4-48h 35 24-48h 生化鑒定 TSA-YE純培養(yǎng) 30 24-48h 典型運動 TSB-YE 過氧化氫酶試驗 革蘭氏染色 溶血試驗 麥芽糖葡萄糖硝酸鹽還原試驗甘露醇七葉苷鼠李糖木糖SIM動力培養(yǎng)培養(yǎng)24h培養(yǎng)培養(yǎng)48h食品微生物檢驗方法測試樣品（x g或x mL）+9x mL一次增菌培養(yǎng)基（Half Fraser肉湯） 30培養(yǎng)242h1mL培養(yǎng)液加入 劃線接種Oxford瓊脂 10mL二次增菌培養(yǎng)基中 和PALCAM瓊脂 （Fraser肉湯） 35或37培養(yǎng)482h 30、35或 劃線接種Oxford瓊脂 37培養(yǎng)24-48h 和PALCAM瓊脂 30、35或37培養(yǎng)24-48h

36、 李斯特菌屬的確證： - 挑取可疑菌接種TSAYE培養(yǎng)基 - 過氧化氫酶試驗 - 革蘭氏染色 - 動力試驗 單核細胞增生李斯特菌的確證： - 溶血試驗 - 碳源利用試驗 - CAMP（協(xié)同溶血）試驗 食品微生物檢驗方法OXA瓊脂lFDA：灰黑色菌落，周圍有黑色環(huán)。lISO：生長在牛津瓊脂上24h的典型李 斯特氏菌呈?。?mm）、灰色的菌落 外圍是黑色的暈輪；48h后菌落變暗，可能見到綠色的輝光，直徑約2mm。 有黑色的暈輪并且中間凹陷。Oxford 瓊脂平板培養(yǎng)于30適合于僅受額外菌群輕度污染的食品，對于受額外菌群重度污染的食品，最好培養(yǎng)于35或37，因為李斯特氏菌趨于和額外菌群一同生長。 食

37、品微生物檢驗方法PALCAM瓊脂菌名生長情況菌落形態(tài)及培養(yǎng)基變化大腸桿菌完全抑制培養(yǎng)基顏色無變化金黃色葡萄球菌部分抑制菌落及其周圍培養(yǎng)基變黃糞鏈球菌完全抑制培養(yǎng)基顏色無變化英諾克李斯特氏菌生長良好灰綠色菌落，周圍培養(yǎng)基變黑綿羊李斯特氏菌生長良好灰綠色菌落，周圍培養(yǎng)基變黑單增李斯特氏菌生長良好灰綠色菌落，周圍培養(yǎng)基變黑ISO：對于微需氧培養(yǎng)的平板，培養(yǎng)后將平板暴露在空氣中1h， 使得培養(yǎng)基重新恢復其品紅至紫色。經(jīng)過24h培養(yǎng)后，李斯特氏菌呈小或細小的灰綠色或橄欖綠色菌落，有時中心黑色，但常常帶有黑色的暈圈。48h培養(yǎng)后，呈現(xiàn)直徑1.5至2.0mm的綠色菌落，中心下陷并圍有黑色的暈圈。 食品微生物

38、檢驗方法傘狀動力傘狀動力l挑取TSBYE肉湯培養(yǎng)物穿刺接種SIM或半固體動力培養(yǎng)基試管試管，25培養(yǎng)5-7d。l李氏菌有動力、呈現(xiàn)典型的傘狀生長傘狀生長。典型運動典型運動l挑取25培養(yǎng)的TSAYE平板上的菌落， 制備水浸片，顯微鏡下觀察 李氏菌的翻滾、旋轉運動。過氧化氫酶試驗過氧化氫酶試驗l李氏菌過氧化氫酶陽性食品微生物檢驗方法l制備57%羊血瓊脂平板。l挑取TSAYE平板上的典型菌落刺種血平板，刺種時避免接觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時接種陽性（單核細胞增生李斯特氏菌）和陰性（英諾克李斯特氏菌）對照。l單增呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的-溶血；l西爾李氏菌出現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象；l綿羊李氏菌通常呈寬的、 輪廓清晰的-溶血；l英諾克李氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。食品微生物檢驗方法l方法：在羊血瓊脂平板上平行接種