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1、哺乳細(xì)胞蛋白表達(dá)案例哺乳細(xì)胞蛋白表達(dá)案例1. 實驗?zāi)康囊钥蛻籼峁┑哪康牡鞍谆驑?gòu)建表達(dá)載體,通過哺乳表達(dá)體系獲得目的蛋白X。2. 實驗設(shè)計(1)分析客戶提供的目的蛋白序列,設(shè)計蛋白表達(dá)方案;(2)選擇鐘鼎特色載體pAZ-V5,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pAZ-V5-X;(3)轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá),通過Western Blot檢測蛋白X是否表達(dá);(4)通過Ni柱純化獲得目的蛋白X,SDS-PAGE檢測純化蛋白純度,BSA方法測定蛋白濃度。3. 蛋白分析(1)經(jīng)EditSeq翻譯目的蛋白X序列:m.w.=39.27kd,pI=8.52(2)經(jīng)UniProt匹配,蛋白X物種來源:草魚(3)目的基因稀有密碼
2、子分析及蛋白結(jié)構(gòu)分析目的基因稀有密碼子分析蛋白親疏水分析 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析 蛋白信號肽預(yù)測分析結(jié)果:目的基因不含哺乳表達(dá)體系稀有密碼子。目的蛋白整體呈親水性、無跨膜結(jié)構(gòu)域、無信號肽序列。結(jié)論:將目的基因構(gòu)建在鐘鼎特色載體pAZ-V5上,利用載體自帶信號肽分泌表達(dá),并在目的蛋白C端添加His標(biāo)簽便于純化。4. 表達(dá)載體構(gòu)建4.1 pAZ-V5-X質(zhì)粒酶切驗證:鐘鼎特色載體pAZ-V5酶切鑒定Marker: 250,500,750,1000,1500,2000,2500,3000,4000,5000,6000,8000,12000Line1:酶切前質(zhì)粒Line2: 酶切后質(zhì)?;蛎Q:X(OD2
3、60/OD280:1.82)酶切位點:EcoRI/BamHI4.2 pAZ-V5-X質(zhì)粒測序驗證:部分序列比對結(jié)果圖5. 蛋白表達(dá)及純化純化蛋白Western Blot鑒定分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: 純化蛋白蛋白表達(dá) Western Blot鑒定分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: 細(xì)胞裂解上清2: 細(xì)胞上清3: 細(xì)胞裂解上清(陰性)4: 細(xì)胞上清(陰性)純化蛋白X SDS-PAGE膠灰度值分析 純化蛋白X SDS-PAGE(reduced)分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: 純化蛋白6. 蛋白內(nèi)毒素檢測凝膠半定量試驗:平行管供試品稀釋倍數(shù)陰性對照陽性對照反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)Log10平均值Log10-11:21:41:81:161:321:641+-+1:2(0.5)-0.301-0.3010.5(1:2)2+-+1:2(0.5)-0.301純化蛋白內(nèi)毒素濃度=鱟試劑靈敏度×反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)的幾何平均值 =0.03EU/ml×2=0.06EU/ml7. 實驗結(jié)論目的蛋白X在293F細(xì)胞中得到表
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