鼻咽癌放療后化療敏感性的變化(一)

1、鼻咽癌放療后化療敏感性的變化(一)    【關(guān)鍵詞】 鼻咽腫瘤；腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的；基因,mdr1；P-糖蛋白；放射治療；化療敏感性摘要 目的 檢測鼻咽癌CNE1細(xì)胞X射線照射前后多藥耐藥基因（mdr1基因）及其編碼產(chǎn)物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是否表達，以及化療藥物敏感性的變化。方法 利用RT-PCR、Western blotting和流式細(xì)胞儀（FCM）檢測CNE1細(xì)胞X射線照射前后的mdr1基因和P-gp的表達及對柔紅霉素（daunorubicin,DNR）的外排功能。結(jié)果 鼻咽癌CNE1細(xì)胞射線照射前mdr1基因、P-gp不

2、表達；射線照射后較長時間內(nèi)mdr1基因、P-gp均長時間表達。CNE1細(xì)胞射線照射后對DNR的蓄積作用略有降低。結(jié)論 鼻咽癌CNE1細(xì)胞X射線照射后化療敏感性降低。關(guān)鍵詞 鼻咽腫瘤；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的；基因，mdr1；P-糖蛋白；放射治療；化療敏感性The change of chemotherapy sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell after radiotherapyAbstract Objective To examine the expression of multidrug resistance gene(mdr1) and P-

3、glycoprotein(P-gp) in nasopharyngeal carcinoma(NPC) CNE1 cell before and after radiotherapy,as well as the changes of chemotherapy sensitivity.Methods The expression of mdr1 gene and its protein P-gp was assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting.Flow cy

4、tometry (FCM) was performed to examine the function of cell efflux to daunorubicin.Results Expression of mdr1-mRNA and P-gp of CNE1 cell in long time after radiotherapy was found,but not before.Intracellular daunorubicin(DNR) accumulation of CNE1 cell decreased after radiotherapy.Conclusion Irradiat

5、ion decreases the chemotherapy sensitivity of CNE1 cell.Key words nasopharyngeal carcinoma;tumor cells,cultured;Genes mdr1;P-glycoprotein;radiotherapy;chemotherapy sensitivity中晚期鼻咽癌的治療原則為放療、化療綜合治療。按照化療安排在放療前、放療同時和放療后分為：誘導(dǎo)化療、同步化療和輔助化療，目前上述各種匹配方法臨床上都有應(yīng)用。以前往往著眼于化療后的MDR，但在射線照射后mdr1及P-gp的表達和功能尤其在鼻咽癌細(xì)胞及其基

6、礎(chǔ)研究較少。多藥耐藥基因（mdr1基因）擴增及其編碼產(chǎn)物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的過度表達是目前已發(fā)現(xiàn)的最重要的一種多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）機制，大多數(shù)腫瘤MDR的發(fā)生被認(rèn)為與mdr1有關(guān)。我們所說的MDR一般是指由化療引起的，但放療是否會引起MDR呢？本研究觀察體外培養(yǎng)的鼻咽癌CNE1細(xì)胞X線照射前后mdr1基因和P-gp的表達和功能的變化。1 材料與方法1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清及1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)37.0 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化、傳代。射線照射后繼續(xù)培養(yǎng)兩周后，每隔4天消化一

7、次細(xì)胞凍存用于RT-PCR檢測和Western blotting分析。1.3 射線照射 取指數(shù)生長期細(xì)胞進行射線照射。照射源：美國VARIAN 2300 C/D型雙光子直線加速器；照射條件：應(yīng)用X射線，劑量率200 cGy/min,照射劑量：4 Gy;照射野大?。?5 cm×15 cm。照射前有物理室測量照射劑量率，并對培養(yǎng)皿進行衰減校正。把培養(yǎng)皿置于照射野中心。1.4 RT-PCR檢測 參照文獻1方法。1.5 Western blotting分析 亦參照文獻1方法。1.6 流式細(xì)胞儀檢測 待細(xì)胞長滿單層用于流式細(xì)胞儀檢測：（1）取未經(jīng)X射線照射的CNE1細(xì)胞作為陰性對照，以排除細(xì)胞

8、自身發(fā)光；（2）分取未經(jīng)X射線照射、經(jīng)X射線照射4Gy后經(jīng)2次傳代的CNE1細(xì)胞，加入可自發(fā)紅色熒光的柔紅霉素2,使培養(yǎng)基中柔紅霉素終濃度達2 mol/L。經(jīng)X射線照射，加入柔紅霉素的CNE1細(xì)胞，作為陽性對照（3）2 h后0.25%胰酶消化收獲細(xì)胞，冷PBS(0 )吹洗、離心3次后，用500 l冷PBS吹散細(xì)胞；（4）在流式細(xì)胞儀上檢測（激發(fā)光源波長488 nm,濾過光源波長575 nm）。每個標(biāo)本檢測的細(xì)胞數(shù)超過10000個。2 結(jié)果2.1 RT-PCR結(jié)果 CNE1細(xì)胞X射線照射前均未觀察到mdr1 mRNA的表達；X射線照射后mdr1 mRNA均長時間穩(wěn)定表達（見圖1）。2.2 Wes

9、tern blotting 結(jié)果 CNE1細(xì)胞X射線照射前均未觀察到P-gp的表達； X射線照射后P-gp基本上均長時間明顯表達（見圖2）。2.3 FCM結(jié)果 FCM檢測到：射線照射后CNE1的陽性細(xì)胞數(shù)不變，但細(xì)胞內(nèi)的DNR平均熒光度略有降低。說明：CNE1細(xì)胞射線照射后對DNR的敏感性略有降低（見圖3、4）。1:射線照射前的CNE1細(xì)胞;6:DNA Marker;25,710:射線照射后每4天的CNE1細(xì)胞圖1圖2 略3 討論多藥耐藥是腫瘤化療失敗的主要原因之一，是指腫瘤細(xì)胞先天存在或經(jīng)化療藥物治療后，表現(xiàn)出不僅對所用化療藥物產(chǎn)生耐藥性，而且對許多結(jié)構(gòu)無關(guān)和作用機制完全不同的其他抗癌藥物產(chǎn)

10、生耐藥性。1976年Juliano與Ling首先觀察到具有MDR 表型的CHO細(xì)胞內(nèi)藥物積聚發(fā)生障礙,分子量為170 kD 的膜糖蛋白-P糖蛋白過度表達。該細(xì)胞攝入藥物與敏感細(xì)胞沒有差異，但藥物外排能力卻加強，表明P-gp能調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性,影響藥物在細(xì)胞內(nèi)積聚3隨后一系列研究證明MDR細(xì)胞抗藥程度及胞內(nèi)藥物積聚與P-gp過度表達有關(guān)4，5 。P-gp是由mdr1基因編碼、由1280個氨基酸殘基組成、分子量為170 kD的跨膜蛋白。在腫瘤細(xì)胞中，圖3 圖4 略P-gp通過ATP供能，將長春新堿、秋水仙素、放線菌素D等藥物泵出細(xì)胞外導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。現(xiàn)已證實編碼人P-gp的基因（mdr1）位于第

11、7號染色體7q21，含28個外顯子，全長為4.5 Kb。中晚期鼻咽癌的治療一般采取放療、化療綜合治療的原則。按照化療安排在放療前、放療同時和放療后分為：誘導(dǎo)化療、同步化療和輔助化療，目前上述各種匹配方法臨床上都有應(yīng)用。以前往往著眼于化療后的MDR，但在射線照射后mdr1及P-gp的表達尤其在鼻咽癌細(xì)胞及其基礎(chǔ)研究較少。在其他腫瘤方面，Nielsen D等7報道：鼠Ehrlich腹水腫瘤細(xì)胞(EHR2)體外分次照射后獲得MDR 表型， P-gp表達水平升高6。Osmak M等報道：人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）射線照射后對長春新堿抵抗，并認(rèn)為與P-gp有關(guān)。Hill BT等8用中國倉鼠卵巢腫瘤細(xì)胞(C

12、HO)、 人卵巢癌細(xì)胞經(jīng)X線照射均獲得MDR 表型，P-gp過度表達。來自臨床的研究也報道放療后殘存的口腔癌組織P-gp表達明顯上調(diào)9。放射線是否可誘發(fā)多藥耐藥，目前結(jié)論尚不一致。Hill、Mattern、Thacker10，11等的實驗研究支持分次或單次放射可增強mdr1mRNA的表達，提示可誘發(fā)多藥耐藥傾向。但Sanchez等12采用2Gy×7次和2Gy×14次的照射方式，可降低耐藥基因的表達，提高對化療藥物的敏感性。雖然在耐藥細(xì)胞系中，有mdr1基因擴增，但大多數(shù)研究認(rèn)為，人體內(nèi)P-gp的高表達并不是mdr1基因擴增的結(jié)果，而是mdr1基因轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物13。因此，研

13、究MDR多在mRNA和蛋白質(zhì)水平，本實驗應(yīng)用敏感性高的RT-PCR與Western blotting方法檢測到鼻咽高分化鱗癌細(xì)胞CNE1射線照射后較長時間內(nèi)mdr1基因、P-gp均明顯表達，提示射線照射后鼻咽癌細(xì)胞可能產(chǎn)生多藥耐藥傾向。當(dāng)然，在體內(nèi)的實際情況都需進一步驗證。參考文獻2 平寶紅,周淑蕓,劉啟發(fā),等.4種細(xì)胞因子對K56/S及其耐藥細(xì)胞株K562/A02積蓄柔紅霉素的影響.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000,20(2):158-160.3 Juliano RL，Ling V.A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chi

14、nese hamster ovary cell mutants.Biochem Biophys Acta,1976,455(1):152-162.4 Lehne G,Elonen E,Baekelandt M,et al.Challenging drug resistance in cancer therapy.Acta Oncol,1998,37(5):431-439.6 Nielsen D,Maare C,Eriksen J,et al.Expression of P-glycoprotein and multidrug resistance associated protein in E

15、hrlich ascites tumor cells after fractionated irradiation.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2001,51(4):1050-1057.7 Osmak M,Miljanic S,Kapitanovic S.Low doses of gamma-rays can induce the expression of mdr gene.Mutat Res,1994,324(1-2):35-41.8 Hill BT,Moran E,Etievant C,et al.Low-dose twice-daily fractiona

16、ted X-irradiation of ovarian tumor cells in vitro generates drug-resistant cellsoverexpressing two multidrug resistance-associated proteins,P-glycoproteinand MRP1.Anticancer-Drugs,2000,11(3):193-200.9 Ng IO,Lam KY,Ng M,et al.Expression of P-glycoprotein, a multidrug-resistance gene product, is induc

17、edby radiotherapy in patients with oral squamous cell carcinoma.Cancer,1998,83(5):851-857.10 Hill BT,Deuchars K,Hosking LK,et al.Overexpression of P-glycoprotein in mammalian tumor cell lines after fractionated X irradiation in vitro.J Natl Cancer Inst,1990,82:607-612.11 Mattern J,Efferth T,Volm M.Overexpression of P-glycoprotein in human lung carcinoma xenografts after fractionated irradiation in vivo.Radiat Res,1991,127(3):335-338.12 Sanchez AM,Barrett JT,Schoenlein PV.Fractionated ionizing radiation accel