大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)

1、大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)專業(yè)：計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)生物信息處理方向姓名：張鋰倩手寫簽名：班級(jí)：一班學(xué)號(hào)：20107660159大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)Thephosphotransferasesystem(PTS)ofE.coli摘要:細(xì)菌是種非常節(jié)儉又聰明的細(xì)胞生物體，他們的體積小，新陳代謝快，許多情況下都生存在惡劣的環(huán)境當(dāng)中，因而在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生了一套巧妙的方法以適應(yīng)其接觸的環(huán)境，以達(dá)到最好的物盡其用。細(xì)菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，通?？s寫為PTS,正是這些方法當(dāng)中的一個(gè)典型例子。通過PTS的作用機(jī)制，即在糖酵解等生化反應(yīng)當(dāng)中的磷酸化和去磷酸化的基團(tuán)轉(zhuǎn)移過程以達(dá)到細(xì)菌細(xì)胞中糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與分配，對(duì)于細(xì)菌

2、的物質(zhì)，能量利用，碳水化合物運(yùn)轉(zhuǎn)代謝，分解物代謝阻遏,碳源儲(chǔ)備與平衡乃至整個(gè)新陳代謝系統(tǒng)都起著至關(guān)重要的作用。PTS是運(yùn)載體家族當(dāng)中的轉(zhuǎn)位分子，在原核生物和古細(xì)菌中廣泛存在。此處以大腸桿菌(E.coli)為例，通過對(duì)大腸桿菌的PTS的結(jié)構(gòu)，功能和作用機(jī)制等各方面的初步分析與研究，進(jìn)一步了解它的效應(yīng)和生物影響，控制反應(yīng)中產(chǎn)生的消極影響，以便更好地應(yīng)用在工業(yè)等方面的生產(chǎn)當(dāng)中提高效率。1 關(guān)鍵詞：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；E.coli;糖酵解；磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移；Abstract:Bacteriaisverythriftyandintelligentcellorganisms,theyhavesmallsizean

3、dfastmetabolism.Butinmanycasestheyalwaysliveinharshenvironments,thustheydevelopedasmartwaytoadopttheenvironmenttheymeetduringthelong-termevolutionary,sothattheycanmakemostuseofresources.Phosphotransferasesystemofbacteria,usuallyabbreviatedasPTS,isatypicalexampleofthesemethods.ThroughthePTSofthemecha

4、nism,thephosphorylationanddephosphorylationofthegrouptransferprocessintheglycolyticandotherbiochemicalreactionsinordertoachieveasugartransporterdistributionofthebacterialcells,whichplaysavitalroleinbacterialsubstancesandenergyutilization,metabolismofcarbohydratesoperation,themetabolicrepressordecomp

5、osition,carbonsourcereservesandbalance,eventhewholemetabolicsystem.HeremakeE.Coliasanexample,preliminarilyanalysisandresearchvariousaspectsofthestructure,functionandmechanismofE.coliPTS,thenlearnmoreaboutitsbiologicaleffects,andcontrolnegativereactioninordertobetterapplyinindustrialandotheraspectsof

6、theproductiontoimproveefficiencyKeywords:phosphatetransferaseenzymesystem;E.coli;glycolysis;transferofphosphategroups;摘要I引言1PTS的結(jié)構(gòu)與功能11.1 細(xì)菌磷酸轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)11.2 E.COLI的PTS三維結(jié)構(gòu)與各蛋白組分功能12 E.COLI的PTS蛋白組分氨基酸序列3PTS的作用機(jī)制與研究方法42.1 PTS作用機(jī)制43 PTS的研究方法6PTS的生理意義與改進(jìn)63.1 PTS的生理意義6PTS存在的問題與改進(jìn)7結(jié)論8參考文獻(xiàn)8引言:蛋白的磷酸化及去磷酸化狀態(tài)在分解物

7、代謝阻遏中起關(guān)鍵作用。PTS系統(tǒng)是運(yùn)載體家族中的轉(zhuǎn)位分子，這是原核生物與古生菌獨(dú)有的系統(tǒng)模式，在動(dòng)植物體內(nèi)卻不存在這個(gè)系統(tǒng)作糖酵解中的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。粗略的引入，PTS包括EI,HPr,EIIo前兩者為胞質(zhì)可溶型蛋白，沒有底物識(shí)別特異性。分別由pstI,pstH操縱子編碼；后者多為蛋白復(fù)合體，對(duì)碳水化合物具有識(shí)別特異性，可特異性識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)底物分子E.coli編碼約20種EUs,涉及20多種不同碳化物磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)。大腸桿菌就是主要通過PEP-sugarPTS以集團(tuán)轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行葡萄糖的攝取。下面將從E.coli的PTS的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)域，蛋白相關(guān)組分功能，氨基酸序列，作用機(jī)制過程等多方面內(nèi)容整體了解PTS的

8、相關(guān)信息，從而進(jìn)一步學(xué)習(xí)細(xì)菌節(jié)儉使用資源，更好的適應(yīng)不同環(huán)境而產(chǎn)生的巧妙機(jī)制過程。1. PTS的結(jié)構(gòu)與功能1.1 細(xì)菌磷酸轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)早在1964年，Kundig,Ghosh和Roseman就給出了PEP一糖的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)這一發(fā)現(xiàn)的報(bào)告。30年后，我們的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)PTS的功能不僅體現(xiàn)在糖的磷酸化系統(tǒng)當(dāng)中，同時(shí)也作為調(diào)節(jié)大量多變的新陳代謝過程以及控制大量基因表達(dá)的復(fù)合蛋白激酶。根據(jù)最近操縱子與基因組序列的工程研究結(jié)果顯示，新的PTS蛋白編碼基因已被發(fā)現(xiàn)，其中的大部分也已經(jīng)被功能性定義。他們之中有一些區(qū)別于先前已經(jīng)識(shí)別的編碼基因而言，顯現(xiàn)了出與細(xì)胞作用過程相關(guān)的作用。過去以及現(xiàn)在相關(guān)PTS研究的

9、基本因素已簡明被論述，近期的進(jìn)展也被整合成概念性圖片以便為將來的研究提供指導(dǎo)性依據(jù)。1.2 E.coli的PTS三維結(jié)構(gòu)與各蛋白組分的功能我們已經(jīng)知道，PTS控制著細(xì)菌中對(duì)糖的利用。在引言當(dāng)中也提到了PTS的蛋白結(jié)構(gòu)組分，粗略的講述了各部分的功能與調(diào)控基因。下面將從三維圖譜，文字解說各方面詳細(xì)介紹其中的細(xì)節(jié)PTS由可溶性EI、磷酸組氨酸搬運(yùn)蛋白HPr和EHs構(gòu)成。其中，EI、HPr蛋白都是可溶性、無底物識(shí)別特異性的胞內(nèi)蛋白，由ptsHI操縱子編碼。EI有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是N-端結(jié)構(gòu)域(EIN),它用于結(jié)合Hpr；另一個(gè)是C-端結(jié)構(gòu)域(EIC),它包含了二聚體界面。EI可將來自磷酸烯醇式丙酮酸(

10、PEP)的磷?；鶊F(tuán)依次傳遞給HPr、Ens和葡萄糖，進(jìn)而完成葡萄糖磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)。Hpr是含組氨酸的磷酸載體蛋白，有組氨酸的活性位點(diǎn)。磷酸化的HPr是所有PTS當(dāng)中EII的磷酸通用供體。而EUs則是一系列蛋白，可以特異性識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)底物分子，對(duì)碳水化合物具有特異性，包括EIIMan、EIIFru、EIIBgl、EHAGlc、EHCBGlc等。E.coli編碼約20種EHs,涉及20多種不同碳化物磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)，其中crr基因編碼的EHAGlc以及ptsG基因編碼的EnCGlc在葡萄糖磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)中起主要作用，EnAGlc蛋白的磷酸化及去磷酸化狀態(tài)在分解物代謝阻遏中起關(guān)鍵作用。由EHCBGlc介導(dǎo)的高效葡萄

11、糖磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)易導(dǎo)致糖酵解循環(huán)和三竣酸循環(huán)的不平衡，會(huì)產(chǎn)生大量乙酸。圖1展示了PTS的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)與蛋白組成。(圖1摘自DavidS.Goodsell.BacterialPhosphotransferaseSystem.PSI.2012)1.3 E.coli的PTS蛋白組分部分相關(guān)的氨基酸序列在上一小節(jié)的介紹當(dāng)中，對(duì)于PTS的三維結(jié)構(gòu)我們已有了進(jìn)一步的了解。在NCBI的網(wǎng)站上可以搜索到許多相關(guān)PTS的信息。從CN3ES個(gè)軟件中也可以更清晰的看到它的立體圖譜與氨基酸序列。下面將做出展示。圖2和圖3分別從不同的角度展示了E.coli中PTSN,N-二乙?；鶜ざ欠种У腅IIA溶液結(jié)構(gòu)模型。（圖2,圖

12、3是作者在CN3E搜到此模型的三維結(jié)構(gòu)圖在兩種不同視角下的圖樣截取。摘自TangC,W川iamsDC,GhirlandoR,CloreGMJ.Biol.Chem.2005）其顯示的氨基酸序列如下：（圖4）IKSjiicHhvveiijIiishyialkqikqgdfuihm9dqsniLilneihlvqtkliMda;qknkrilv|vhqlhtut!aeehevvmjEiinstar51availkqik（|；dfladaodqumahuh!vqtkEieedisejkmkvUvlvhaqlhltnt!/M_CndeevvcngIiinr中川口川IkqakqgdfmhnmdqsimaI

13、fluhIvqt1（IiejdagegkmkvsIvlvhaqlhlmt!圖42. 注：CN3D1動(dòng)態(tài)的立體三維結(jié)構(gòu)圖，當(dāng)點(diǎn)擊不同的氨基酸序列時(shí)會(huì)在圖中作出相應(yīng)色彩標(biāo)注，在實(shí)際操作中會(huì)更清晰地看到。在此處只能展示一部分靜態(tài)效果。因查到的資料有限，此處只能給出以EIIA為例的圖解。其他不再一一給PTS的作用機(jī)制與研究方法2.1 PTS作用機(jī)制PTS在大腸桿菌可參與多種碳源的磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)。一些組成性的和可誘導(dǎo)的大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)在細(xì)胞膜上存在特定的葡萄糖識(shí)別蛋白（通透酶），同事會(huì)影響同葡萄糖磷酸化相耦連的葡萄糖轉(zhuǎn)移的過程。磷酸基團(tuán)的來源是細(xì)胞內(nèi)的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。從能量的角度來看，PE

14、P直接磷酸化通透酶的胞質(zhì)組分是可能的。然而，這個(gè)過程是非常復(fù)雜的；PTS的復(fù)雜性是由于其的多功能能力：它不僅催化糖基轉(zhuǎn)移，還調(diào)控著其他系統(tǒng)的作用過程。磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）穿過膜運(yùn)輸進(jìn)外源性己糖以及從PEP緊密耦合方式運(yùn)輸?shù)教鞘峭ㄟ^幾個(gè)磷酸化中間體的磷酰基實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的。糖類被運(yùn)輸隨之而來的就是PTS的磷酸化。磷酸化的糖類進(jìn)入糖酵解途徑，通常是在葡萄糖-6-P或果糖-6-P的水平上。糖酵解途徑通常會(huì)生成兩分子的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）,其中一分子用來驅(qū)動(dòng)運(yùn)輸過程以及起始糖類的磷酸化。其結(jié)果是，PTS蛋白的磷酸化狀態(tài)同時(shí)依賴于細(xì)胞外糖類的濃度以及細(xì)胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮

15、酸（PEP）和丙酮酸的比率。具體來看此循環(huán)過程，正如圖5,圖6（立體模擬）所示：首先，EI先與PEP反應(yīng)并從PEP處獲得磷酸基團(tuán)，將其加載到組氨酸的磷酸載體蛋白HPr上，然后載體蛋白將磷酸基團(tuán)傳遞給整個(gè)系列當(dāng)中相對(duì)應(yīng)不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。磷酸基團(tuán)在幾種蛋白當(dāng)中穿梭，從HPr移動(dòng)到EIIA,再到EIIB、EIIC,與其共同作用（有時(shí)會(huì)帶上一個(gè)額外的鏈EIID）,此時(shí)從胞外進(jìn)入的碳水化合物進(jìn)過這個(gè)反應(yīng)便成磷酸化型碳水化合物（通常可以是葡萄糖或者果糖），然后他們就再進(jìn)入糖酵解途徑，生成的PEP再次循環(huán)此過程。糖類的流動(dòng)與代謝進(jìn)行得以推進(jìn)。EII里的每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由EII自身的各個(gè)集成物組成，有時(shí)他們會(huì)作為隔

16、離蛋白存在，有時(shí)又會(huì)在一個(gè)長鏈蛋白質(zhì)中作為一連串相互連結(jié)的結(jié)構(gòu)區(qū)域。（圖5摘自DavidS.Goodsell.BacterialPhosphotransferaseSystem.PSI.2012(10);圖6摘自JosefDeutscher,ChristorFrancke,PieterW.Postma.HowPhosphotransferaseSystem-RelatedProteinPhosphorylationRegulatesCarbohydrateMetabolisminBacteria.MicrobiologyandMoleculaiBiologyReviews.2006.)Fru-

17、lt6-bisPFbaTPGlyceraldehyde-3-PEIIApEHADh并PHPrHPrpPi+NAD憶NADH*4IaPElPElPykPyruvatPhosphoenolpynivale*ATPADPEno13-bisP-glycerleADPtatp*41Pglc3-P-glycerate2-P-glycerateH2O圖6圖6中黑體的各個(gè)蛋白酶縮寫如下:Pgi:phosphoglucoseisomerase;Pfk:phosphofructokinase;Fba:fructose-1,6-bisphosphatealdolase;Tpi：triose-phosphateiso

18、merase;Gap:glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase；Pgk:phosphoglyceratekinase;Pyk:pyruvatekinase;Eno:enolase；Pgm:phosphoglyceratemutase;2.2 PTS的研究方法我們已經(jīng)知道，大腸桿菌的PEP-PTS包括一系列負(fù)責(zé)在轉(zhuǎn)移過程中從磷酸烯醇式丙酮酸（PEP向葡萄糖轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)的蛋白質(zhì)。對(duì)于包含在通過PTS進(jìn)行磷酸轉(zhuǎn)移的過程以及PTS蛋白參與調(diào)控過程的機(jī)制的理解在很大程度上是通過蛋白組分的相互作用的種類的三維結(jié)構(gòu)的可視化來實(shí)現(xiàn)的。人們已經(jīng)利用X衍射晶體學(xué)和NMR（核磁

19、共振）對(duì)PTS的單個(gè)的蛋白（酶I、HPr、IIA）進(jìn)行了廣泛的特征分析。磷酸載體蛋白之間以及與調(diào)節(jié)目標(biāo)之間相互作用的機(jī)制同樣適合用核磁共振光譜的方法研究。EIN-HPr復(fù)合體是到現(xiàn)在為止被NMRB析的最大的結(jié)構(gòu)之一。這個(gè)結(jié)構(gòu)測(cè)定采用了為了指定的目的以及為了特異地觀察EIN和HPr之間的分子間核Overhauser增強(qiáng)（NOE接觸而利用的多種同位素標(biāo)記（15N,13C和/或2H）的蛋白質(zhì)的組合去簡化光譜的多維異核NM班譜技術(shù)。止匕外，殘基兩極的耦連技術(shù)也被用來提供對(duì)于決定復(fù)合體中兩個(gè)蛋白的方向極為有用的長程定向信息。NMRF究使得揭示包括PTS蛋白的蛋白一蛋白之間相互作用成為可能。目前酶I和HP

20、r之間以及HPr和IIAG1c之間的氨基末端結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)也已成功獲取。3. PTS的生理意義與改進(jìn)3.1 PTS的生理意義：碳水化合物運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝；分解物代謝阻遏；碳源儲(chǔ)備；協(xié)調(diào)碳氮代謝平衡等。3.2 PTS存在的問題與改進(jìn)功能型PTS介導(dǎo)的葡萄糖磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)以如下化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行：Glucose+PEP-Glucese-6-P+Pyruvate這一反應(yīng)減小了以PEP為前體的化合物的產(chǎn)量，積累的丙酮酸進(jìn)而會(huì)轉(zhuǎn)化為乙酸，這樣就增加了代謝副產(chǎn)物大量積累，產(chǎn)生的乙酸鹽會(huì)進(jìn)一步抑制菌體生長。從而有了利在代謝工程中對(duì)PTS的分子改造進(jìn)展。代謝工程就是利用重組DNA及其他技術(shù)，有目的地改變生物中已有的代謝和表

21、達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以更好地理解細(xì)胞的代謝途徑，并用于化學(xué)轉(zhuǎn)化、能量轉(zhuǎn)移及大分子裝配過程目前，PTS分子改造主要有兩種策略：一是敲除葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋EIICBGlc（ptsG編碼）；另一策略是敲除ptsHIcrr操縱子，使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于GalP和Glk途徑（由葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EnCBGlc（ptsG基因編碼）葡萄糖通過GalP、Glk協(xié)同作用途徑進(jìn)入細(xì)胞的途徑，是以ATP為磷酸基團(tuán)供體而非消耗PEP,此途徑可增加胞內(nèi)PEP含量，具有減小過流代謝和解除葡萄糖效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)。G/ucoseGaiactoseTHTDP-Gic丁一GlycolysisUDPGIgnAgGalE2EnergyUDp，GaJ

22、NAcdTDP-4keto-6-deoxy-GicRmIB4(fTDP-4-ketQ-L-Rhe1RmID4dTDPRha圖7展示了在大腸桿菌當(dāng)中，葡萄糖G轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖G-6-P具有兩種途徑：PTS途徑和Glk途徑。可以配合于對(duì)PTS分子改造中的的第二種方法來看更易于理解。（圖7摘自KarenL.Visick,ThereseM.OShea,AdamH.Klein,KatiGeszvain,AlanJ.Wolfe.TheSugarPhosphotransferaseSystemofVibriofischeriInhibitsbothMotilityandBioluminescence.N

23、CBI.2007.）結(jié)論：此論文用三章的內(nèi)容系統(tǒng)的講述了以大腸桿菌為例的原核生物的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS。從中我們可以了解到，PTS的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成與作用過程十分復(fù)雜，卻相當(dāng)有效。這是細(xì)菌利用自身巧妙的生化作用機(jī)制以達(dá)到最大程度利用有限資源的方法之一。這樣他們可以更好地適應(yīng)環(huán)境。所以細(xì)菌是非常聰明的。在網(wǎng)上各種不同的學(xué)術(shù)科研網(wǎng)站（尤其以英文為主）如非常熟悉的NCBI,EMBL,PDB,PIB,等中都可以查到相關(guān)的期刊文獻(xiàn)及對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。通過查到的資料再加上自己的理解，對(duì)PTS這方面的知識(shí)有了更全面的認(rèn)識(shí)，有些國外文獻(xiàn)內(nèi)容需要翻譯理解，這對(duì)英語水平也是一個(gè)考察。整理好后就形成了PTS蛋白組分結(jié)構(gòu)功

24、能，部分在CN3D三維結(jié)構(gòu)中顯示的氨基酸序列，以及PTS的作用機(jī)制與研究方法，生物學(xué)意義改進(jìn)方法的進(jìn)展等這些內(nèi)容。我想通過對(duì)PTS的研究進(jìn)展在工業(yè)應(yīng)用當(dāng)中誠然非常重要。因?yàn)榇竽c桿菌是常用的工程菌種，對(duì)它實(shí)行這種代謝途徑上的控制和改造可以很好地提高細(xì)菌的利用率與工業(yè)生產(chǎn)。第一篇論文的完成實(shí)屬不易，從沒有任何經(jīng)驗(yàn)到自己翻閱上網(wǎng)查資料能寫出來東西并真正學(xué)到心里，這個(gè)學(xué)習(xí)的過程比只考一張無趣的卷子有意義得多。所以感謝老師能讓我們有此機(jī)會(huì)，以這種方式學(xué)習(xí)到一些有用的東西。參考文獻(xiàn)：1周軍智.大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸一糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS系統(tǒng)）分子改造及敲除菌性能測(cè)定.中國知網(wǎng).2012.2韓聰，張惟

25、材，游松，黃留玉.大腸桿菌ptsG基因敲除及其缺陷株生長特性研究J.生物工程學(xué)報(bào).2004.3李寅，曹竹安.微生物代謝工程：繪制細(xì)胞工廠的藍(lán)圖J.化工學(xué)報(bào).2004.4張惟材，朱厚礎(chǔ).重組大腸桿菌的發(fā)酵與代謝工程J.微生物學(xué)通報(bào).1999.5Cao,Y.,etal.Crystalstructureofaphosphorylation-coupledsaccharidetransporter.Nature473,50-55.2011.6Deutscher,J.,Francke,C.&Postma,P.W.Howphosphotransferasesystem-relatedproteinphos

26、phorylationregulatescarbohydratemetabolisminbacteria.Microbiol.Mol.Biol.Rev.2006.7FloresS,GossetG,FloresN,etal.AnalysisofcarbonmetabolisminEscherichiacolistrainswithaninactivephosphotransferasesystemby13ClabelingandNMRspectroscopy.MetabolicEngineering.2002.8Gutknecht.R;Manni.M;Mao.Q;Erni.B.TheJournalofBiologicalChemistry.1998.9Hu,J.,etal.SolutionNMRstructuresofproductiveandnon-productivecomplexesbet-weentheAandBdomainsofthecytoplasmicsubunitofthemannosetransporteroftheEscherichiacoliphosphotransferasesystem.J.Biol.Chem.283,2008.10Kotrba,P.Inui,M.&Yukawa,H.Bacterialphosphotr