血管性癡呆大鼠海馬中葛根素低氧誘導(dǎo)因子

1、血管性癡呆大鼠海馬中葛根素低氧誘導(dǎo)因子            免疫組化染色(SP法)及結(jié)果判定  將所取之腦塊自前向后行冠狀切片，片厚3m，梯度乙醇脫蠟至水，3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2室溫孵育40min，微波抗原修復(fù)10min，室溫冷卻2h，正常血清封閉40min，分別滴加第一抗體(兔抗大鼠HIF1親合純化抗體，工作濃度為1200；兔抗大鼠EPO單克隆抗體，工作濃度為1200)，4過(guò)夜，生物素化二抗室溫孵育40min，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液室溫孵育30

2、min，DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染核，脫水、透明、封片。TBS緩沖液分別代替一抗經(jīng)上述步驟染色作空白對(duì)照。取假手術(shù)組、2VO組和葛根素組各時(shí)間點(diǎn)兩指標(biāo)(HIF1和EPO)分別經(jīng)SP染色所得的切片各6張，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬和大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞，以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)鮮艷的棕黃色顆粒的有核細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片高倍鏡(10×40倍)下隨機(jī)選擇5個(gè)不同的視野(均取自海馬CA1區(qū))，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中1mm×1mm面積中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。關(guān)鍵詞：葛根素；血管性癡呆；低氧誘導(dǎo)因子1；促紅細(xì)胞生成素ABSTRACT: Objective  To observe th

3、e effects of puerarin on the expression of hypoxia inducible factor1and erythropoietin in the hippocampus of vascular dementia rats and to investigate its possible mechanisms. Methods  Rats of experimental group were treated with a permanent bilateral common carotid arteries (CCA) occlusion (2V

4、O) to establish vascular dementia model. Male SD rats were randomly divided into three groups: shamoperated group, 2VO group and puerarin group(twentyfour rats in each group). Rats were evaluated on learningmemory ability by Ytype water maze test. At corresponding time points at 1w, 3w, 6w and 2mon,

5、 the dynamic expression of HIF1 and EPO in CA1 region of hippocampus was determined by immunohistochemical method. Results  The swimming time and error times of rats in 2VO group and puerarin group were significantly increased; but at all time points the rats in puerarin group showed better per

6、formance than those in 2VO group. Both in 2VO group and puerarin group, the number of HIF1 and EPO positive cells in hippocampal CA1 region were much more than that in shamoperated group; but the expression of HIF1 and EPO at each point in puerarin group was distinctly less than that in 2VO group. C

7、onclusion  Puerarin can increase the intracellular oxygen concentration and improve learningmemory ability during cerebral ischemia, and it has definitely protective effects on VD.KEY WORDS: puerarin; vascular dementia; hypoxiainducible factor1; erythropoietin葛根素是從中藥葛根中提取的主要有效成分之一，是一種異黃酮類化合物，具有

8、明確的擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用，已被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor1, HIF1)是低氧應(yīng)答時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個(gè)核心調(diào)節(jié)因子。紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)編碼基因是HIF1下游40余種靶基因之一。葛根素對(duì)HIF1和EPO在血管性癡呆(vascular dementia, VD)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)的影響及其是否通過(guò)HIF1/EPO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮對(duì)VD的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。1  材料與方法1.1  動(dòng)物分組  健康、雄性SD(SpragueDawley)大

9、鼠72只，體重(280±20)g，鼠齡2-3月(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。經(jīng)Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選后，隨機(jī)平均分為三大組：假手術(shù)組、2VO組和葛根素組，每組再根據(jù)缺血時(shí)間血管分離暴露(阻斷)至開(kāi)胸灌注的時(shí)間隨機(jī)分為4個(gè)小組(每小組6只)：1周組；3周組；6周組；2月組。1.2  主要試劑  葛根素注射液為陜西安康制藥廠生產(chǎn)；HIF1兔抗大鼠親合純化抗體來(lái)自武漢博士德生物工程有限公司；EPO兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒來(lái)自北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3  模型的建立  VD動(dòng)物模型的

10、制作參照de la Torre等采用的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性阻斷法(2VO)進(jìn)行。0.67mol/L水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠取頸前部正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid arteries, CCA)，套以1號(hào)手術(shù)線雙重結(jié)扎，逐層縫合。手術(shù)期間嚴(yán)密觀察呼吸變化，保證有自主呼吸。假手術(shù)組動(dòng)物僅分離暴露雙側(cè)CCA而不結(jié)扎；葛根素組于術(shù)前3d至術(shù)后1周，每天給予葛根素注射液100mg/kg腹腔注射，手術(shù)當(dāng)天于結(jié)扎前1h給藥；癡呆組于相同的時(shí)間分別給予等量0.16mol/L氯化鈉溶液腹腔注射。1.4  學(xué)習(xí)記憶的測(cè)定  應(yīng)用Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠

11、學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)估。Y型水迷宮裝置分為一個(gè)長(zhǎng)臂(長(zhǎng)50cm)和兩個(gè)短臂(長(zhǎng)40cm)，各臂高45cm，寬30cm，長(zhǎng)臂為起始區(qū)，其中一個(gè)短臂為迷路區(qū)(盲端)，上覆有不透明塑料板，形成暗道，另一短臂為安全區(qū)，裝有平臺(tái)(30cm×10cm)，上方有燈光照明。以大鼠自迷宮起始區(qū)游至終點(diǎn)安全臺(tái)所需時(shí)間和途中進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)，作為衡量學(xué)習(xí)、獲得鞏固記憶能力的指標(biāo)。每只大鼠于測(cè)試當(dāng)天共游迷宮10次，測(cè)定學(xué)習(xí)成績(jī)；24h后重復(fù)上述過(guò)程測(cè)定記憶成績(jī)。實(shí)驗(yàn)前先行水迷宮實(shí)驗(yàn)，淘汰游泳能力差或智力低下(以游全程時(shí)間大于平均成績(jī)的3倍以上即t25s作為界點(diǎn))的大鼠；術(shù)后1周、3周、6周、2月的各時(shí)間點(diǎn)的大

12、鼠均于處死前再次行Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。1.5  標(biāo)本的采集  雙側(cè)CCA分離暴露(結(jié)扎)后1周、3周、6周、2月的各時(shí)間點(diǎn)，再次麻醉大鼠，開(kāi)胸灌注，斷頭取腦，取前囟后3mm至上丘平面間包含海馬的腦組織塊，1.39mol/L多聚甲醛固定、石蠟包埋。1.6  免疫組化染色(SP法)及結(jié)果判定  將所取之腦塊自前向后行冠狀切片，片厚3m，梯度乙醇脫蠟至水，3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2室溫孵育40min，微波抗原修復(fù)10min，室溫冷卻2h，正常血清封閉40min，分別滴加第一抗體(兔抗大鼠HIF1親合純化抗體，工作濃度為1200；兔抗大鼠EPO單克隆抗

13、體，工作濃度為1200)，4過(guò)夜，生物素化二抗室溫孵育40min，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液室溫孵育30min，DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染核，脫水、透明、封片。TBS緩沖液分別代替一抗經(jīng)上述步驟染色作空白對(duì)照。取假手術(shù)組、2VO組和葛根素組各時(shí)間點(diǎn)兩指標(biāo)(HIF1和EPO)分別經(jīng)SP染色所得的切片各6張，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬和大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞，以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)鮮艷的棕黃色顆粒的有核細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片高倍鏡(10×40倍)下隨機(jī)選擇5個(gè)不同的視野(均取自海馬CA1區(qū))，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中1mm×1mm面積中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。1.7 

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 12. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)法，并應(yīng)用Correlate進(jìn)行相關(guān)性分析，取P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。2  結(jié)    果2.1  VD模型制備情況  2VO組死亡4只，葛根素組死亡2只(1只大鼠因術(shù)中損傷迷走神經(jīng)迅速死于呼吸衰竭)，術(shù)后24h內(nèi)，大鼠出現(xiàn)四肢抽搐、翻滾、扭轉(zhuǎn)痙攣后呼吸停止死亡，以上大鼠不列入統(tǒng)計(jì)，另隨機(jī)選取大鼠補(bǔ)齊；假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡。結(jié)扎后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)大鼠眼瞼下垂，起初興奮不安，可有共濟(jì)失調(diào)，隨后肢體功能活

15、動(dòng)逐漸恢復(fù)，無(wú)明顯運(yùn)動(dòng)障礙，但自發(fā)活動(dòng)減少，行動(dòng)遲緩，性格執(zhí)拗。葛根素組大鼠上述變化較癡呆組明顯改善。假手術(shù)組大鼠較術(shù)前無(wú)明顯變化。             2VO組和葛根素每只大鼠斷頭取腦時(shí)均再次檢查雙側(cè)CCA結(jié)扎情況，若無(wú)絲線滑脫、松解(實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)所有大鼠雙側(cè)CCA均結(jié)扎完好，造成了有效的腦缺血)，而且其學(xué)習(xí)記憶成績(jī)相對(duì)于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組大鼠明顯降低(P<0.05)，則認(rèn)為造模成功。2.2  學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)  游全程所用時(shí)間越長(zhǎng)，誤入暗道的錯(cuò)誤

16、次數(shù)越多，說(shuō)明其學(xué)習(xí)記憶保持能力越差，提示學(xué)習(xí)記憶受損越重。缺血1周時(shí)，假手術(shù)組、2VO組和葛根素組三組大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均無(wú)明顯差異(P>0.05)；缺血3周、6周、2月時(shí)，與假手術(shù)組相比，2VO組和葛根素組的大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均明顯下降(P<0.05)，但葛根素組各時(shí)間點(diǎn)學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均較2VO組有明顯提高(P<0.05，表1、表2)。表1  不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)（略）表2  不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的記憶成績(jī)（略）2.3  HIF1和EPO的表達(dá)  2VO組和葛根素組各時(shí)間點(diǎn)、各大鼠海馬和大腦皮層均可見(jiàn)不同數(shù)量的HIF1表達(dá)，以缺血1周時(shí)最

17、明顯，此后緩慢下降，但仍處于較高水平，主要是海馬和皮層的錐體細(xì)胞，血管內(nèi)皮亦有明顯HIF1陽(yáng)性細(xì)胞分布，胞漿、胞核均有明顯著色(圖1、圖2)。EPO亦于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯表達(dá)于2VO組和葛根素組大鼠的海馬各區(qū)和大腦皮層，其蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化的規(guī)律與HIF1大致相同(圖3)，而且在2VO組和葛根素組，HIF1和EPO兩蛋白的表達(dá)在P0.01水平上呈顯著正相關(guān)(r2VO=0.953，rPu=0.931)。除神經(jīng)元外，EPO還大量表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，主要是胞漿表達(dá)(圖4)。假手術(shù)組HIF1和EPO陽(yáng)性細(xì)胞偶見(jiàn)(圖5、圖6)；葛根素組各時(shí)間點(diǎn)兩蛋白的表達(dá)與2VO組相比明顯減少(表3

18、、表4)。圖1  2VO組1周時(shí)海馬CA1區(qū)HIF1的表達(dá)（略）圖2  2VO組HIF1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)（略）圖3  2VO組1周時(shí)海馬CA1區(qū)EPO的表達(dá)（略）圖4  2VO組EPO在室管膜細(xì)胞的表達(dá)（略）圖5  假手術(shù)組1周時(shí)海馬CA1區(qū)HIF1的表達(dá)（略）圖6  假手術(shù)組1周時(shí)海馬CA1區(qū)EPO的表達(dá)（略）表3  不同實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（略）表4  不同實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)EPO的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（略）2.4  大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與HIF1、EPO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的關(guān)系 

19、2VO組和葛根素組大鼠兩蛋白表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶能力在P0.01水平上呈顯著相關(guān)(表5)。假手術(shù)組兩蛋白表達(dá)與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均無(wú)相關(guān)性。表5  HIF1和EPO的表達(dá)與大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)的關(guān)系（略）3  討    論HIF1作為具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的DNA結(jié)合性蛋白質(zhì)因子，對(duì)缺氧具有特異感受性。在缺氧條件下，HIF1廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)，通過(guò)作用于靶基因的缺氧反應(yīng)元件調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，引起細(xì)胞一系列對(duì)缺氧的反應(yīng)，以保持機(jī)體的氧穩(wěn)態(tài)，具有重要的病理生理學(xué)意義。HIF1是由和亞基組成的異二聚體，其中亞基受低氧誘導(dǎo)表達(dá)，是調(diào)節(jié)HIF1活性的功能亞單位。

20、EPO是一種水溶性、含唾液酸的酸性糖蛋白，除作為造血因子調(diào)節(jié)和維持血液中紅細(xì)胞水平外，腦源性EPO還可以通過(guò)拮抗興奮性氨基酸毒性、清除自由基、抗炎癥、抗凋亡、提高神經(jīng)突觸傳遞以及類似神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子樣作用發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)作用，有助于新生神經(jīng)元的產(chǎn)生和缺損功能的修復(fù)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2VO組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1和EPO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于假手術(shù)組，兩種蛋白表達(dá)的時(shí)間規(guī)律和組織分布呈顯著一致性，并且2VO組兩種蛋白的表達(dá)在缺血各時(shí)間點(diǎn)與其相應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶能力在P=0.01水平上呈顯著相關(guān)，從而表明HIF1和EPO參與了VD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并可能通過(guò)HIF1/EPO缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮了保護(hù)作用。VD存

21、在的組織、細(xì)胞缺氧使HIF1表達(dá)大量增加，激活了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HIF1，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄其下游靶基因，主要包括：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth fractor, VEGF)及其受體VEGFR；葡萄糖載體蛋白(glucose trnsporter, GLUT)、腺苷酸激酶(adenylate kinase, AK)和醛縮酶(aldolaseA, ALDA)、丙酮酸激酶M(pyruvate kinase M, PKM)、乳酸脫氫酶A(lactatedehedrogenaseA, LDHA)等糖酵解酶；血紅素加氧酶(hemeoxygenase1, HO1)、誘導(dǎo)型NO

22、合酶(iducible nitricoxide synthase, iNOS)、內(nèi)皮素1(endothelin 1, ET1)；P21、P53、Bcl2、Bax9；胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulinlike growing factor 1, IGF1)；腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin,AM)；EPO等40余種蛋白和酶的編碼基因，從而參與調(diào)控血管生成、能量代謝、血管舒縮反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與增殖、紅細(xì)胞生成、自由基清除、抗興奮性氨基酸毒性等諸多病理過(guò)程，此過(guò)程也是VD發(fā)生的可能的神經(jīng)生化、血管改變、能量轉(zhuǎn)換機(jī)制。葛根素，化學(xué)名4,7二羥基8D葡萄糖基異黃酮，是中藥葛根的主要有效成分。本研

23、究從造模后動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)、反應(yīng)速度等一般行為學(xué)情況以及大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)等方面直接證實(shí)了葛根素對(duì)VD具有確切的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)葛根素組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于2VO組，由于細(xì)胞內(nèi)氧濃度對(duì)HIF1的表達(dá)進(jìn)行著精細(xì)的調(diào)節(jié)，隨著細(xì)胞內(nèi)氧分壓的下降，HIF1的表達(dá)呈指數(shù)增加，所以葛根素組各時(shí)間點(diǎn)HIF1表達(dá)顯著低于2VO組。這一結(jié)果間接證明了葛根素可以促進(jìn)缺血腦組織的血流灌注、提高缺血區(qū)氧濃度。我們推測(cè)其機(jī)制可能與葛根素的以下作用有關(guān)：擴(kuò)張腦血管，增加血流量，改善腦微循環(huán)；抑制血小板聚集；主要成分為異黃酮，具有雌激素替代效應(yīng)，抗凋亡，保護(hù)神經(jīng)元；鈣拮抗；清除自由基；拮抗谷氨酸等

24、興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用；降低血糖；降低血漿血栓素A2/前列環(huán)素水平。雖然葛根素組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1和EPO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)介于假手術(shù)組和2VO組之間，但也不能排除葛根素可能是通過(guò)上調(diào)保護(hù)性因子HIF1發(fā)揮對(duì)VD的保護(hù)作用，要進(jìn)一步明確上述保護(hù)作用是否與HIFl/EPO低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)還需要進(jìn)一步研究。本研究從動(dòng)物行為學(xué)和免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)方面證實(shí)了葛根素在VD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)缺血神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床上葛根素治療VD提供了有力的依據(jù)。葛根素的這一積極作用，也為應(yīng)用祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥治療缺血(缺氧性)腦血管病展示了美好的前景。參考文獻(xiàn)：1De la Torre JC, Fortin T, Park GA, et al. Chronic cerebrov