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文檔簡介

1、實驗十 載體構(gòu)建實驗?zāi)康模?能夠綜合運用DNA回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定篩選重組質(zhì)粒等分子生物學(xué)技術(shù)。 設(shè)計重組載體時的注意事項設(shè)計重組載體時的注意事項 目的DNA插入克隆載體 在克隆載體的MCS中選擇合適的酶切位點： 通過引物設(shè)計在目的片段兩端加上酶切位點 注意在外源DNA片段的內(nèi)部不會出現(xiàn)這些酶切位點 目的DNA插入表達載體 除上述注意事項，引物設(shè)計時還要注意讀碼框要和表達載體的讀碼框一致實驗流程 第一天： 電泳PCR產(chǎn)物并回收 雙酶切目的片段及質(zhì)粒 電泳檢測、回收上述兩種DNA 電泳檢測回收產(chǎn)物 連接反應(yīng)（過夜） 空閑時間準(zhǔn)備LA（含50g/ml氨芐青霉素）平板，LB培養(yǎng)

2、基，試管及牙簽滅菌。 第二天： 下午做轉(zhuǎn)化實驗 第三天：保存平板，留待下周提質(zhì)粒鑒定電泳鑒定或 PCR鑒定2000100020001000（加樣量同（加樣量同marker）目的片段目的片段乙組提乙組提pUC1820ng/l原始原始pUC18原始原始pUC18HindIII、EcoRI雙酶切50 l體系 待酶切DNA：不超過2.5 g 10Y buffer: 10 l （工作液濃度為2) EcoRI: 1 l HindIII: 1l -1.5 l 加ddH2O至總體積為50 l 37孵育1小時T4 DNA 連接酶 20 l體系 pUC18 200-400ng 待插入的DNA片段 10 buffer：2 l T4 DNA 連接酶： 1.5 l 加ddH2O至總體積為20 l15孵育4-18小

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