河南省驢寄生圓線蟲的研究----相關(guān)知識

1、系統(tǒng)發(fā)生樹（英文：Phylogenetic tree）又稱為演化樹（evolutionary tree），是表明被認為具有共同祖先的各物種間演化關(guān)系的樹。是一種親緣分支分類方法（cladogram）。在樹中，每個節(jié)點代表其各分支的最近共同祖先，而節(jié)點間的線段長度對應(yīng)演化距離（如估計的演化時間）。分子診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。分子診斷是預(yù)測診斷的主要方法，既可以進行個體遺傳病的診斷，也可以進行產(chǎn)前診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。分子診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)和生物芯片技術(shù)。 1.核酸分子雜交技

2、術(shù) 具有一定互補序列和核昔酸單鏈在液相或固相中按堿基互補配對原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測核酸序列和探針序列。應(yīng)用該技術(shù)可對特定DNA或RNA序列進行定性或定量檢測。 2.聚合酶鏈反應(yīng)(即lymerase chain reaction，PCR) 原理：PCR是模板DNA,引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，擴增出所需目的DNA。包括三個基本步驟：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈(變性)；在低溫下引物與單鏈DNA互補配對(退火)；在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸。 3.生物芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的分子生

3、物學(xué)與微電子技術(shù)相結(jié)合的核酸分析檢測技術(shù)。最初的生物芯片技術(shù)主要目標是用于DNA序列測定、基因表達譜鑒定和基因突變體檢測和分析，所以又稱為DNA芯片或基因芯片技術(shù)。由于目前這一技術(shù)已擴展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯片、免疫芯片、細胞芯片、組織芯片等，所以改稱生物芯片技術(shù)更符合發(fā)展趨勢。PCR原理 DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，

4、加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。 發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶-Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大 量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一

5、定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。限制性片段長度多態(tài)性（

6、RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技術(shù)于1980年由人類遺傳學(xué)家Bostein提出。它是第一代DNA分子標記技術(shù)。DonisKeller利用此技術(shù)于1987年構(gòu)建成第一張人的遺傳圖譜。DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)是進行基因組研究的基礎(chǔ)。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變，或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致

7、酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構(gòu)建分子圖譜。該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，對于不同種群的生物個體而言，他們的DNA序列存在差別。如果這種差別剛好發(fā)生在內(nèi)切酶的酶切位點，并使內(nèi)切酶識別序列變成了不能識別序列或是這種差別使本來不是內(nèi)切酶識別位點的DNA序列變成了內(nèi)切酶識別位點。這樣就

8、導(dǎo)致了用限制性內(nèi)切酶酶切該DNA序列時，就會少一個或多一個酶切位點，結(jié)果產(chǎn)生少一個或多一個的酶切片段。這樣就形成了用同一種限制性內(nèi)切酶切割不同物種DNA序列時，產(chǎn)生不同長度大小、不同數(shù)量的限制性酶切片段。后將這些片段電泳、轉(zhuǎn)膜、變性，與標記過的探針進行雜交，洗膜，即可分析其多態(tài)性結(jié)果。PCR-RFLP: 是在 PCR 和 DNA 序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的 RFLP 技術(shù)。該方法是通過 PCR 擴增一段 DNA 片段，然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，消化 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)電泳，可得到有特異性的電泳譜帶，從而達到鑒定不同基因型的目的。 Tris中文品名: 三羥甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 緩血酸胺 英文

9、品名: Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane 英文別名: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol THAM; Tris base; Trometamol 通用CAS : 77-86-1 產(chǎn)品純度: 100%(USP藥典級) / 99.9%(實驗室技術(shù)級) 產(chǎn)品級別: USP藥典級,符合USP/EP/cGMP對藥物賦形劑的要求 分 子 式: NH2C(CH2OH)3 分 子 量: 121.14 使用用途: 生物制藥,體外診斷,個人護理及化妝品原料等 保存溫度: 常溫密封避光保存 TRIS是一種最常用的生物緩沖液，常

10、配成PH值為6.8，7.4，8.0，8.8。其PH值隨溫度變化很大。一般來說，溫度每升高一度，PH值下降0.03。 1M TRIS-HCl 6.8和1.5M TRIS-HCl 8.8是SDS-PAGE最常用的試劑。 而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA電泳最常用的試劑，TE（PH8.0）主要用于溶解DNA。TE為 Tris加EDTA合稱。 緩沖特性：Tris為弱堿，在室溫（25）下，它的pKa為8.1；根據(jù)緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH7.0到9.2之間。Tris堿的水溶液pH在10.5左右，一般加入鹽酸以調(diào)節(jié)pH值至所需值，即可獲得該pH值的緩沖液。但同時應(yīng)注意溫度對于Tris的pKa的影響。由于Tris緩沖液為弱堿性溶液，DNA在這樣的溶液中會被去質(zhì)子化，從而提高其溶解性。人們常常在Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”，TE緩沖液被用于DNA的穩(wěn)定和儲存。如果將調(diào)節(jié)pH值的酸溶液換成乙酸，則獲得“TAE緩沖液”（Tris/Acetate/EDTA），而換成硼酸則獲得“TBE緩沖液”（Tris/Borate/EDTA）。這兩種緩沖液通常用于核酸電泳實驗中。 制備：Tris可以由兩步反應(yīng)生成：先由硝基甲烷生成中間體三羥甲基硝基甲烷（(HOCH2)3CNO2），然后再由該中間體還原得到Tris。 用途：Tris緩